生物細胞作用8篇

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篇1

【關(guān)鍵詞】 骨髓細胞；成骨細胞；生長物質(zhì)；組織工程

0引言

骨骼損傷、腫瘤等導致的骨缺損是骨科每天都要面臨的問題，臨床醫(yī)生通常是通過自體或異體骨移植方法來解決缺損問題，但這種方法存在著來源有限、增加創(chuàng)傷、排斥反應及疾病傳播等問題. 由于利用組織工程學原理與方法再生的骨組織植入體內(nèi)無免疫排斥的危險且來源充足，因此它的優(yōu)勢逐漸得到認同［1］ . 近年來，組織工程迅猛發(fā)展并且是目前公認的最有可能在臨床取得實際效益的研究領(lǐng)域之一［2］. 但是要真正廣泛應用于臨床，還必須解決好組織工程的三大關(guān)鍵問題即種子細胞、可降解的生物支架及生長因子. 骨髓來源的骨髓基質(zhì)干細胞(marrow stromal stem cells， MSCs)由于取材容易，易于體外培養(yǎng)和誘導，是目前最有前途成為組織工程種子細胞來源的細胞［3-4］. 組織工程是將細胞與材料復合，從而構(gòu)建植入人體的活材料. 在此過程中，目的細胞的生長調(diào)控是十分重要的一環(huán)，因此對生長因子的作用及其機制的研究是組織工程的重要內(nèi)容. 生長因子是通過細胞間信號傳遞影響細胞活動的一類多肽因子，它對細胞具有促進或抑制其分裂增殖、遷移和基因表達的作用. 生長因子對目的細胞作用有利于在體外構(gòu)建與體內(nèi)更為相似的模擬環(huán)境，從而為體內(nèi)試驗奠定基礎(chǔ).

1骨髓基質(zhì)干細胞及成骨誘導

目前，骨組織工程種子細胞的分離主要有三種來源：骨髓來源、骨膜來源和松質(zhì)骨來源［5］. 種子細胞的培養(yǎng)是骨組織工程的前提與基礎(chǔ). MSCs 由于其強大的增殖能力與多向分化潛能成為骨組織工程的種子細胞之一［6］.

骨髓是由造血系統(tǒng)和基質(zhì)系統(tǒng)組成的復合組織，它除了是造血干細胞的主要來源外，同時成人的骨髓組織中還存在著骨髓間質(zhì)干細胞. 20世紀70年代中期，F(xiàn)riedenstein等［7］報道，骨髓標本中小部分貼附細胞在培養(yǎng)過程中能夠分化形成類似骨或軟骨的集落，這部分貼壁的細胞就是骨髓基質(zhì)干細胞，也叫間質(zhì)干細胞. 這種間質(zhì)干細胞具有多方向的分化潛能，可以分化成為骨、軟骨、肌肉、韌帶、肌腱和脂肪等組織［8-9］. 間質(zhì)干細胞的多向分化特性使之成為組織工程的理想細胞來源，是目前骨組織工程普遍選用的細胞. 近年來的許多組織工程研究均采用了人或動物的骨髓間質(zhì)干細胞，其結(jié)果十分令人滿意［10-11］.

現(xiàn)有的MSCs培養(yǎng)方法主要為應用誘導劑 (地塞米松、β甘油磷酸鈉、抗壞血酸) 和生長因子進行誘導，但誘導效果均不甚理想. 國內(nèi)外研究者發(fā)現(xiàn)， MSCs的分化具有位點特異性，即在何種微環(huán)境中培養(yǎng)MSCs，就傾向于向這類環(huán)境中的細胞分化. 根據(jù)MSCs分化的位點特異性，在骨組織工程中欲把MSCs誘導分化為成骨細胞，采用模擬成骨微環(huán)境來誘導MSCs的增殖與成骨分化可能也是一種有效的誘導方法［12-13］.

2骨組織工程相關(guān)因子

生長因子的合理應用對構(gòu)建骨組織工程起著關(guān)鍵的作用. 骨組織擁有一個龐大的生長因子庫，目前在骨組織中發(fā)現(xiàn)了十幾種生長因子，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有多種細胞因子對成骨過程具有重要的調(diào)節(jié)作用，可以誘導成骨、促進細胞增殖和膠原合成、促進成骨和血管生長以及在骨吸收改建方面發(fā)揮作用，因此在構(gòu)建組織工程骨時對成骨因子合理使用或調(diào)控成骨細胞的適時適量表達十分重要.

2.1血管內(nèi)皮生長因子VEGF又稱血管通透因子(VPF)或（VAS），是近年來發(fā)現(xiàn)的一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細胞生長因子，對胚胎發(fā)育及切口修復等生理功能有重要意義. VEGF是一種糖蛋白，其相對分子量為34~45 ku由兩個相對分子量各為17 ~22 ku的不同亞單位組成的二聚體，VEGF就是由于該基因的剪切方式不同所形成的系列產(chǎn)物. 人至少有4種VEGF，分別為VEGF121， VEGF165， VEGF189和VEGF206. 近年來研究表明，血管內(nèi)皮生長因子對中胚層細胞分化有作用，可以使骨髓基質(zhì)干細胞向成骨分化. Midy等［14］發(fā)現(xiàn)，外源性VEGF能使體外培養(yǎng)的成骨細胞堿性磷酸酶(ALP) 活性及cAMP濃度提高4倍. VEGF誘導成骨細胞遷移，增加ALP活性，同時成骨細胞自身合成VEGF. PGE1， PGE2， 1， 25(OH)維生素D3及IGFⅠ能增加成骨細胞VEGF mRNA的表達.

2.2腫瘤壞死因子TNF是一種糖蛋白的低聚物，分子量為39~70 ku，是多功能的細胞因子，主要由活化的巨噬細胞和T細胞產(chǎn)生. TNF是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的直接殺傷腫瘤細胞作用最強的生物活性因子之一. TNF分兩大類：由活化的巨噬細胞產(chǎn)生的稱為TNFα，由活化的T細胞產(chǎn)生的TNF稱為TNFβ，它們共同作用于同一受體. TNF可刺激培養(yǎng)的成骨細胞和骨器官合成RNA和PGE2，TNF可以抑制膠原和骨鈣素的合成以及1， 25(OH)維生素D3刺激的ALP活性，但它可刺激Ι型膠原mRNA表達，這說明TNF的這種膠原合成抑制作用受翻譯后產(chǎn)物的調(diào)節(jié)［15］.

2.3骨形成蛋白BMP是廣泛存在于骨基質(zhì)中的一種酸性糖蛋白，是目前唯一被確認具有異位成骨能力的生長因子，它能在體內(nèi)、外誘導骨髓基質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為成骨細胞，使高分化的骨細胞群體數(shù)量保持穩(wěn)定. Okubo等［16］用支架材料與不同劑量的BMP復合后植入兔下頜骨的骨缺損中，3 wk后ALP和組織學檢查發(fā)現(xiàn)新骨形成，證實BMP誘導成骨系軟骨內(nèi)化骨形成過程，且成骨量隨BMP劑量增加而增加，有明顯的劑量依賴性. 陳克明等［17］認為： BMP與纖維蛋白制成的復合物，具有良好的骨誘導活性. 載體包容BMP等誘導因子可有效緩慢的釋放，以發(fā)揮其誘導作用. 余家闊等［18］認為，在BMP誘導下，無論是幼稚軟骨細胞還是成熟軟骨細胞都有表達成骨細胞表型的趨勢. 目前認為BMP是骨組織工程中促進成骨作用最重要的一種，近年來BMP作為一種有價值的生長因子越來越受到人們的重視，然而其誘導成骨的機制目前卻并不完全清楚. 但由于BMP在骨組織中含量極少且在體內(nèi)擴散很快，容易被蛋白酶所分解，因而不能在局部發(fā)揮持續(xù)刺激和誘導成骨作用，其誘導活性難以得到充分的發(fā)揮［19］.

2.4轉(zhuǎn)移生長因子TGFβ是一種有多種功能的單鏈多肽，分子量為25ku，具有對骨組織、結(jié)締組織及免疫系統(tǒng)等細胞的調(diào)節(jié)功能，其調(diào)節(jié)作用包括細胞生長調(diào)節(jié)和分化誘導兩方面. 目前發(fā)現(xiàn)有5種亞型，分別為TGFβ1~TGFβ5. TGFβ廣泛存在于多種組織及轉(zhuǎn)化細胞中，其中以骨組織、血小板、軟骨組織中含量最豐富，而TGFβ受體在成骨細胞表達最多，表明TGFβ的主要作用是調(diào)節(jié)骨代謝. 有實驗表明TGFβ對膠原基因表達和膠原的合成具有促進作用. TGFβ可促進細胞增殖與分化，促進細胞外基質(zhì)合成，也是多種免疫細胞的自分泌或旁分泌的調(diào)節(jié)因子［20］.

TGFβ為主要成骨因子之一，它誘導間充質(zhì)細胞合成軟骨特異性蛋白聚糖和Ⅱ型膠原，刺激成骨細胞的增殖及膠原合成. TGFβ在體外對成骨細胞的作用很復雜，部分取決于TGFβ的濃度、細胞密度、種系和成骨細胞的分化階段. 多數(shù)研究認為TGFβ能抑制成骨細胞游離鈣的合成、增加成骨細胞分化以及成骨細胞膠原和ALP的表達. TGFβ對成骨細胞生長有調(diào)控作用，這種作用在一定程度上表現(xiàn)為雙相性. 研究表明，含血清培養(yǎng)的成骨細胞，低濃度的TGFβ可以刺激細胞DNA和膠原合成，抑制ALP活性，刺激細胞生長；而高濃度則抑制膠原合成，對DNA合成無作用. 無血清培養(yǎng)的成骨細胞，高濃度TGFβ抑制ALP生成. 此外，也有研究表明，TGFβ促進骨髓源性和骨膜源性骨前體細胞趨化到骨軟骨損傷部位，進而增生、分化形成成骨細胞和軟骨細胞 ［21］.

2.5成纖維細胞生長因子FGF是一種對中胚層和神經(jīng)外胚層細胞具有促有絲分裂作用的多肽生長因子. 它對成骨細胞具有促增殖作用，并且通過增殖骨細胞數(shù)目促進骨形成. FGF分為酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)和堿性成纖維細胞生長因(bFGF)兩種. aFGF存在于骨細胞浸出物中，bFGF存在于牛和人的骨骼中，前者較后者低10倍. FGF是毛細血管增殖刺激劑，能夠促進毛細血管向斷端內(nèi)以及骨移植物中長入，使骨修復早期的組織中軟骨島數(shù)量增加，并使骨折斷端骨痂血管重建的時間提前，而且可以增加BMP的成骨量. 目前雖然FGF的作用機制還不是很清楚，但是可以肯定的是局部和全身應用FGF可以促進骨形成. bFGF是一種內(nèi)源性多肽生長因子，有試驗表明它能有促進中胚層和神經(jīng)外胚層細胞有絲分裂的作用 ［22］.

2．6血小板源性生長因子PDGF 首先在血小板中發(fā)現(xiàn)，分子量為28～35 ku，由兩個多肽鍵A和B組成異二聚體，在體外具有促進纖維細胞生長的作用，對所有起源于間葉細胞包括成骨細胞既能促進骨形成，又能刺激骨吸收，起雙向調(diào)節(jié)作用［23］. PDGF還對中胚層細胞有促有絲分裂作用，它對人和鼠成骨細胞及其細胞系均有促有絲分裂作用. 同時它還是一個強力趨化因子，對人和鼠組織中的成骨細胞有強烈的趨化作用. PDGF 是由血小板、巨噬細胞和骨細胞合成，貯存于骨基質(zhì)中. 它在創(chuàng)傷愈合中起重要作用，稱為“創(chuàng)傷因子”. 其主要功能是誘導成骨細胞和骨祖細胞分裂，對于培養(yǎng)的成骨細胞有強烈的趨化作用，能刺激膠原合成. Canalis等［24］發(fā)現(xiàn): PDGF有與IGFⅠ同樣的作用，能刺激鼠骨DNA及膠原合成，但是PDGF也具有促使膠原降解的性能.

2．7類胰島素生長因子IGF家族由兩種相關(guān)多肽組成，即IGFⅠ和IGFⅡ. 它們是骨基質(zhì)中最富含的生長因子，兩者有相似的結(jié)構(gòu)和體外作用，但在體內(nèi)生物學效應不同. IGFI 在細胞增殖及細胞外基質(zhì)合成代謝中具有重要作用. Throp等［25］研究證實了IGFⅠ和TGFβ具有相互作用以促進細胞增殖、膠原及蛋白聚糖合成的作用.

IGFⅡ是重要的細胞內(nèi)調(diào)節(jié)劑，能刺激骨細胞的增生、增加骨細胞的分化和I型膠原合成. Strong等［26］發(fā)現(xiàn)IGFⅡ能在正常人骨細胞培養(yǎng)中24 h 內(nèi)增加原膠原mRNA 2～4 倍.

綜上所述，細胞因子不過是眾多因子中研究較為成熟的幾個，如何把這些因子的作用應用于組織工程中，才是我們研究生長因子的目的. 什么樣的方法才能使細胞因子的活性在組織工程中發(fā)揮最好的作用還要進一步探討.

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篇2

關(guān)鍵詞：成纖維細胞 生物學特性 成骨作用

1　成纖維細胞的來源及其生物學特性

成纖維細胞(fibroblast)是結(jié)締組織中最常見的細胞，由胚胎時期的間充質(zhì)細胞(mesenchymal cell)分化而來。在結(jié)締組織中，成纖維細胞還以其成熟狀態(tài)—纖維細胞(fibrocyte)的形式存在，二者在一定條件下可以互相轉(zhuǎn)變。

不同類型的結(jié)締組織含成纖維細胞的數(shù)量不同。通常，疏松結(jié)締組織中成纖維細胞的數(shù)量比同樣體積的致密結(jié)締組織中所含成纖維細胞的數(shù)量要少，故分離培養(yǎng)成纖維細胞多以真皮等致密結(jié)締組織為取材部位［2，3］。

成纖維細胞形態(tài)多樣，常見的有梭形、大多角形和扁平星形等，其形態(tài)尚可依細胞的功能變化及其附著處的物理性狀不同而發(fā)生改變。成纖維細胞胞體較大，胞質(zhì)弱嗜堿性，胞核較大呈橢圓形，染色質(zhì)疏松著色淺，核仁明顯。電鏡下，其胞質(zhì)可見豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體和發(fā)達的高爾基復合體，表明它具有合成和分泌蛋白質(zhì)的功能。成纖維細胞尚可合成和分泌膠原纖維、彈性纖維、網(wǎng)狀纖維及有機基質(zhì)。它合成的前膠原蛋白分子經(jīng)內(nèi)切酶作用，聚合和重排，可形成與成骨細胞合成分泌的膠原原纖維一樣具有64nm(640?)周期橫紋的膠原原纖維，膠原原纖維經(jīng)互相粘合形成膠原纖維。經(jīng)檢測，這

兩種細胞合成分泌的膠原纖維均是Ⅰ型膠原纖維，在形態(tài)和生化結(jié)構(gòu)上完全相同［4，5］。

處于成熟期或稱靜止狀態(tài)的成纖維細胞，胞體變小，呈長梭形，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復合體均不發(fā)達，被稱為纖維細胞。在外傷等因素刺激下，部分纖維細胞可重新轉(zhuǎn)變?yōu)橛字傻某衫w維細胞，其功能活動也得以恢復，參與組織損傷后的修復。另外，在結(jié)締組織中，仍保留著少量具有分化潛能的間充質(zhì)細胞，它們在創(chuàng)傷修復等情況下可增殖分化為成纖維細胞。

2　成纖維細胞在一般創(chuàng)傷修復中的表現(xiàn)

各種創(chuàng)傷均會造成不同程度的細胞變性、壞死和組織缺損，必須通過細胞增生和細胞間基質(zhì)的形成來進行組織修復。在此修復過程中，成纖維細胞起著十分重要的作用。以傷口愈合過程為例，成纖維細胞通過有絲分裂大量增殖，并從4～5天或6天開始合成和分泌大量的膠原纖維和基質(zhì)成分，與新生毛細血管等共同形成肉芽組織，填補傷口組織缺損，為表皮細胞的覆蓋創(chuàng)造條件。在傷口愈合中，成纖維細胞主要來源于真皮層的局部成纖維細胞和未分化的間充質(zhì)細胞，以及血管周圍的成纖維細胞和周細胞。內(nèi)臟損傷時，參與修復過程的成纖維細胞多來自間質(zhì)和包膜，以及粘膜下或漿膜下層的結(jié)締組織。有人認為創(chuàng)傷愈合過程中傷處聚集的大量成纖維細胞，一方面是由成纖維細胞通過分裂增殖而來，另一方面，更多地是由鄰近的間充質(zhì)細胞、纖維細胞和毛細血管周細胞等演變或游走到傷處。在創(chuàng)傷修復的后期，成纖維細胞通過分泌膠原酶參與修復后組織的改建。在某些病理條件下，以成纖維細胞為主要細胞成分的肉芽組織或增生組織塊還可以在非骨組織內(nèi)發(fā)生鈣化，引起異位骨化(ectopic ossification)。但對于異位骨化的參與細胞及其機制尚不十分清楚，未分化間充質(zhì)細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞和毛細血管周細胞等可劃歸為誘導性骨祖細胞的細胞都有可能參與這一過程［6，8］。

3　成纖維細胞在骨創(chuàng)傷修復過程中的表現(xiàn)

最簡單和常見的骨創(chuàng)傷即是骨折，其愈合過程須經(jīng)過炎性反應、清掃、纖維骨痂和骨性骨痂4個階段［4］。不同階段參與的細胞主體不同。成纖維細胞從骨折第3天起就出現(xiàn)于骨折局部血腫中［6］，骨折后5天即在機化血腫及骨折斷端的間隙及其周圍大量存在，是參與纖維骨痂階段的主要細胞成分［4，5］。在此階段成纖維細胞一方面大量分裂增殖，一方面又合成和分泌大量Ⅰ型膠原，使肉芽組織逐步變成疏松的結(jié)締組織，將骨斷端包圍起來，形成接合兩骨折斷端的巨大的纖維骨痂。然而，這種由無數(shù)成纖維細胞和豐富的肉芽組織為主體構(gòu)成的纖維結(jié)締組織卻不會演變?yōu)樵谄渌M織創(chuàng)傷修復時常見的瘢痕組織，而是通過鈣鹽結(jié)晶在其內(nèi)部不斷沉積，逐漸演變?yōu)楣切怨丘瑁构钦劬植康男迯瓦_到骨性愈合，恢復骨組織的結(jié)構(gòu)。此時，骨折愈合部只有骨組織而不再存在成纖維細胞［4，5，9～11］。

4　成纖維細胞的成骨作用

成纖維細胞在骨折愈合過程中不同于其它組織創(chuàng)傷修復的表現(xiàn)，以及在某些病理條件下可以參與異位骨化［6，7］，使人們對成纖維細胞的分化能力、鈣化骨化能力以及在成骨過程中其成骨能力如何發(fā)揮、細胞演變的最終歸宿如何等等問題產(chǎn)生了濃厚的興趣。對成纖維細胞成骨能力的研究也正是開始于對骨折愈合過程中成纖維細胞表現(xiàn)的觀察。

對骨折局部骨形成區(qū)的電鏡觀察顯示，除了成骨細胞在此發(fā)揮成骨作用外，成纖維細胞確實也存在著類似的成骨表現(xiàn)［4，5，9～13］。例如，在其線粒體內(nèi)可清晰見到鈣鹽顆粒，部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)可見成熟的膠原纖維，分泌到其四周的膠原纖維內(nèi)可見高密度的鈣鹽結(jié)晶沉積。不僅如此，成纖維細胞還能象成骨細胞一樣產(chǎn)生基質(zhì)小泡并引起小泡內(nèi)的鈣鹽沉積。鈣化的基質(zhì)小泡形成叢毛球狀的鈣球，鈣球隨后合并、融合為骨組織。以上種種現(xiàn)象表明，成纖維細胞與成骨細胞一樣具備提供鈣鹽沉積及骨形成所必需的條件。在從纖維性骨痂到骨性骨痂的演變過程中，成纖維細胞也隨之演變?yōu)楣羌毎c成骨細胞的歸宿相一致。但二者在演變過程中的

表現(xiàn)又不盡相同，主要有以下幾點可資鑒別［9，13］：①成纖維細胞及其細胞核均呈不規(guī)則的橢圓形或長方形，而成骨細胞及其細胞核則為邊緣比較光整的橢圓形；②成纖維細胞均單獨存在，細胞之間有眾多的膠原纖維相隔，成骨細胞則以連續(xù)排列的形式出現(xiàn)；③成纖維細胞的細胞質(zhì)內(nèi)溶酶體少見，而成骨細胞的細胞質(zhì)內(nèi)則常有溶酶體可見；④成纖維細胞四周的骨組織都由叢毛球狀鈣球或針狀鈣鹽結(jié)晶組成，成骨細胞則都有一面緊貼比較成熟與致密的骨組織；⑤成骨細胞是一個一個地被骨組織(類骨質(zhì))包圍變?yōu)楣羌毎衫w維細胞則可以是兩個或兩個以上同時被骨組織包圍在一個陷窩內(nèi)，然后再隨著細胞之間基質(zhì)的鈣化而分隔為各占一個骨陷窩。

對成纖維細胞的成骨作用，有學者認為這是成纖維細胞的固有特性在骨折這一特定情況下得以表達的結(jié)果［9，11］。骨折局部活的和失活的骨組織及軟骨組織，以及骨基質(zhì)中的某些大分子都有可能誘導成纖維細胞表達其成骨作用進而演變?yōu)楣羌毎?4，15］。較早在骨基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein， BMP)即對成纖維細胞有一定的誘導作用。對骨折愈合中BMP作用的研究［16，17］，表明創(chuàng)傷使內(nèi)源性BMP呈階段性合成與釋放，并誘導周圍軟組織中的間充質(zhì)細胞或/和成纖維細胞等向成骨方向轉(zhuǎn)化。應用PAP法發(fā)現(xiàn)［16］，骨折后第3、5天局部纖維肉芽組織中的成纖維細胞樣間充質(zhì)細胞內(nèi)以及第14天新生骨小梁間纖維組織中的成纖維細胞樣間充質(zhì)細胞內(nèi)，都與成骨細胞、軟骨細胞和骨基質(zhì)一樣存在BMP，表明這些成纖維細胞樣間充質(zhì)細胞已被誘導為可合成分泌BMP、具有成骨作用的細胞。而Sampath［15］從牛骨基質(zhì)中分離提純得到的成骨素對成纖維細胞的骨誘導能力更是超過了BMP和當時已知的其它骨生長因子。

成纖維細胞在其成骨作用得以表達后，可能通過兩種方式成骨：①膜內(nèi)成骨；②在環(huán)繞軟骨的纖維層內(nèi)成骨。開始分泌膠原纖維后，參與成骨的成纖維細胞只有兩個歸宿［4，5，9，13］：①變性、死亡、碎裂直至消失，這種演變發(fā)生早、范圍廣，故從纖維性骨痂形成開始，就逐漸有基質(zhì)成分發(fā)生鈣化，進而轉(zhuǎn)變?yōu)楣腔|(zhì)；②演變?yōu)楣羌毎@一過程出現(xiàn)較晚，并穿插在前一過程之中，故在形成骨組織的細胞成分的同時，還使豐富的纖維骨痂演變?yōu)楣切怨丘瑁纬晒墙M織。但這種由成纖維細胞演變成的骨細胞，其結(jié)局如何、其生物學特性與由成骨細胞演化而來的骨細胞是否相同仍不清楚。例如，骨細胞從骨陷窩脫離后，可恢復為功能活躍的成骨細胞，再次參與骨組織的形成；而由成纖維細胞演變成的骨細胞在脫離骨陷窩后，是成為成骨細胞還是恢復為成纖維細胞、此時是否還具備成骨作用等一系列問題尚缺乏研究。

5　成纖維細胞體外培養(yǎng)的生物學特性［18］

成纖維細胞的分離培養(yǎng)一開始并不涉及成骨作用，而主要是用于研究細胞的老化、各種外來因子對細胞的損傷、細胞在體外條件下的惡性轉(zhuǎn)化、以及某些先天性代謝異常、酶缺陷等。由于皮膚成纖維細胞易于獲取，又易于在體外生長，故目前皮膚成纖維細胞培養(yǎng)已在基礎(chǔ)醫(yī)學和臨床醫(yī)學研究中得到較廣泛的運用，其分離培養(yǎng)技術(shù)已相對成熟，對其體外生長規(guī)律也有了較全面的認識。

成纖維細胞的原代培養(yǎng)可用酶消化法或組織塊法，其中組織塊法又因其操作簡便、條件易于控制而應用更為普遍。通常，以酶消化法獲得的成纖維細胞懸液在接種后5～10min即可見細胞以偽足初期附著，與底物形成一些接觸點；然后細胞逐漸呈放射狀伸展，胞體的中心部分亦隨之變扁平；最快者大約在接種后30min，細胞貼附底物即較為完全，呈現(xiàn)成纖維細胞的形態(tài)。采用組織塊法則大約在接種后2～3天［2，3］到1周左右，在接種的皮膚組織塊周圍長出細胞。待細胞融合成片，鋪滿培養(yǎng)容器底壁大部分時即可進行傳代。一般都采用胰蛋白酶(trypsin)，將成纖維細胞從底壁消化下來后分瓶作傳代培養(yǎng)。成纖維細胞在體外培養(yǎng)條件下能保持良好的分裂增殖能力。細胞分裂時變?yōu)榍蛐危环至押笥制戒佋诟街锏谋砻娉蔀橛型黄鸬谋馄郊毎ｓw外培養(yǎng)的成纖維細胞，其生命期限與物種等因素有關(guān)。例如：人胚成纖維細胞約可培養(yǎng)50代；恒河猴皮膚成纖維細胞能傳代超過40代；雞胚成纖維細胞則只有少數(shù)能培養(yǎng)30代；而小鼠成纖維細胞多數(shù)只能生長8代左右。另外，從老年個體取得的成纖維細胞的壽命要比取自年輕者短。由于在細胞傳代和進行體外培養(yǎng)時，細胞的生物學特性會逐漸發(fā)生一些不同于體內(nèi)的改變，故通常只將前10代視這正常細胞，可在此時將生長旺盛的成纖維細胞凍存起來，以備將來復蘇使用，這在將培養(yǎng)的細胞由動物實驗向人體實驗過渡的過程中必須給予足夠的重視。

6　成纖維細胞在體外培養(yǎng)中的成骨作用

徐榮輝［2］等通過體外培養(yǎng)家兔皮膚成纖維細胞發(fā)現(xiàn)，經(jīng)傳代培養(yǎng)的成纖維細胞至第8天時，其細胞集落中有不透光的骨小結(jié)節(jié)形成；到37天時，小結(jié)節(jié)擴大、延伸，形成骨小梁樣結(jié)構(gòu)。經(jīng)活體四環(huán)素標記顯示，所形成的結(jié)構(gòu)為新生骨組織。他們還注意到，成纖維細胞在參與骨形成的過程中并無分化為成軟骨細胞或成骨細胞的明確跡象，故推測并未發(fā)生此種分化，而成纖維細胞之所以能發(fā)揮成骨作用，很可能是受某些誘導因素作用的緣故。他們認為用以培養(yǎng)成纖維細胞的中厚皮片中混雜存在的上皮細胞(或/與內(nèi)皮細胞)，可能是誘導成纖維細胞形成骨組織的一種誘導因素。而Friedenstein［6，19］較早的實驗則認為，屬于誘導性骨祖細胞之一種的成纖維細胞，在上皮細胞(如膀胱上皮)或脫鈣骨基質(zhì)等誘導因子作用下，可以分化為成骨細胞進而形成骨組織。鄧廉夫［20］等分離培養(yǎng)取自關(guān)節(jié)內(nèi)的損傷性和晚期骨關(guān)節(jié)炎性的滑膜細胞，發(fā)現(xiàn)其中的成纖維細胞樣細胞增殖迅速，呈束狀或交叉鋪展并可形成多層結(jié)構(gòu)，細胞表面有其分泌物形成的不透光結(jié)節(jié)，經(jīng)四環(huán)素標記、ARS(Alizarinred s)和甲苯胺藍(Toluidine blue)染色，顯示結(jié)節(jié)為新生骨組織。在缺乏常規(guī)的誘導因子——上皮細胞的作用下，取自滑膜的成纖維細胞樣細胞也能發(fā)生成骨作用，他們推測是在關(guān)節(jié)損傷后或骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與發(fā)展過程中，改變的關(guān)節(jié)微環(huán)境(如TNF樣活性物質(zhì)增多等)可能會觸發(fā)滑膜的成纖維細胞與骨形成相關(guān)的多基因表達，使其向成骨型細胞分化，這樣，滑膜成纖維細胞樣細胞在體內(nèi)時即已具備成骨性能，故在培養(yǎng)條件下可發(fā)揮成骨作用。Dodda［21］等的研究則

指出，變性滑膜細胞多種細胞因子和生長因子的表達、關(guān)節(jié)液內(nèi)多種細胞因子的出現(xiàn)，可能是滑膜成纖維細胞樣細胞成骨表型表達的重要始動因素。這些相關(guān)的研究表明成纖維細胞成骨表型的表達可能存在著較復雜的調(diào)控機制，而其誘導因素也是多樣的。

為獲取大量具有成骨表型的成纖維細胞并了解其轉(zhuǎn)化機制，鄧廉夫［22］等將分離純化的人皮膚成纖維細胞置于加有不同濃度EGF、IL-6、TNF-α、BMP-2的培養(yǎng)液中進行體外培養(yǎng)，采用生物化學、組織化學和電鏡觀察等方法檢測成纖維細胞成骨性標記物的形成狀況，發(fā)現(xiàn)TNF-α和BMP-2聯(lián)合應用，可使成纖維細胞分泌堿性磷酸酶、骨鈣素及膠原纖維的量增加；成纖維細胞可由梭形向圓形或多突形轉(zhuǎn)化，蛋白分泌旺盛；細胞外基質(zhì)中，豐富的膠原纖維定向或雜亂排列，其間散在較多的鈣顆粒；細胞可重疊交織形成多層結(jié)構(gòu)，其表面有分泌顆粒和鈣鹽結(jié)晶堆積，并不斷融合擴大成骨結(jié)節(jié)，表明TNF-α和BMP-2可以誘導成纖維細胞成骨。但這種完全由成纖維細胞經(jīng)誘導而形成的骨組織，在缺乏典型的成骨細胞參與下是否能在體外或植入體內(nèi)后經(jīng)改建成為成熟的板層骨及其改建過程如何?仍有待進一步研究。

7　展望

盡管成纖維細胞受哪些因素誘導可以產(chǎn)生成骨作用、這些因素的誘導方式及其機制如何以及成纖維細胞在骨形成中是否分化為成骨細胞等等問題尚未完全解決，但成纖維細胞經(jīng)誘導可以形成骨組織這一現(xiàn)象已逐漸為廣大科學工作者所接受。由于成纖維細胞直接參與了骨折愈合過程中纖維性骨痂的形成，其自身又具備被誘導成骨的能力，可以設(shè)想，利用成纖維細胞分布廣泛、取材方便、對機體損傷較小、體外培養(yǎng)容易成活、增生繁殖較快等較其它具有成骨作用的細胞(如骨膜成骨細胞、骨髓基質(zhì)細胞等)優(yōu)越之處，在體外大量培養(yǎng)擴增成纖維細胞，并施以有效的誘導因素(如上皮細胞、TNG-α和BMP等)使其具備成骨效能，然后與合適的生物材料載體復合，同時使該復合體在體外或體內(nèi)保持良好的成骨能力并進行一定程度的成骨，則有望獲得具有一定的生物力學支撐強度而成骨作用又保持活躍的“活骨”復合體，用以替代自體骨或異體骨回植體內(nèi)治療難以自身修復的較大的骨缺損，這無疑將為骨缺損的修復治療開辟一條新的有輝煌前景的道路。在組織工程技術(shù)和生物材料科學已有較大發(fā)展的今天，這一設(shè)想是極有可能實現(xiàn)的。當然，從目前所處的實驗階段過渡到臨床應用尚有很大一段距離，需要解決的問題還很多，而且隨著研究的展開和深入，問題可能還會越來越多，但這確實是一項很有臨床應用價值和社會、經(jīng)濟效益的重大課題，值得廣大基礎(chǔ)醫(yī)學工作者和臨床科研人員為之而努力。

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篇3

【關(guān)鍵詞】 白楊素； 白血病； 增殖抑制

Anti-proliferation Effect of Phosphorylated Chrysin Derivatives in Leukemia Cells/FU Yun-bi，LIU Zhi-he，PENG Ai-yun.//Medical Innovation of China，2015，12（16）：120-123

【Abstract】 Objective：To investigate the anti-proliferation effect of a series new phosphorylated chrysin derivatives in leukemia cells.Method：The cell viability of the 12 phosphorylated chrysin derivatives in Kasumi-1 cells was detected by MTT assay，and the derivatives with higher proliferation inhibition rate than chrysin were selected out to process the next step to verify the anti-proliferation effect in K562 cells，HL60 cells，U937 cells，and bone marrow mononuclear cells （BMMNC） from acute leukemia patients.Result：Chrysin derivatives 3c and 7a could inhibit the proliferation of leukemia cells in vitro.Conclusion：The new phosphorylated chrysin derivatives 3c and 7a have potential value in anti-leukemia research.

【Key words】 Chrysin； Leukemia； Proliferation inhibition

First-author’s address：The 4th Hospital Affiliated to Medicine College of Ji’nan University，Guangzhou 510220，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.16.044

黃酮類化合物廣泛存在于自然界的某些植物和漿果中，是藥用植物中的主要活性成分之一，亦是人類飲食中的重要組成部分。黃酮類化合物以其廣譜的藥理作用尤其是抗腫瘤作用引人矚目[1-3]。近年來世界上掀起了黃酮類化合物開發(fā)的熱潮。白楊素（chrysin）是被廣泛研究的黃酮類化合物之一，其來源于紫葳科植物木蝴蝶的種子、莖皮，松科植物山白松的心木，芒松的心木等，在蜂膠中的含量較高，是蜂膠的主要有效成分。白楊素的化學名為5，7-二羥基黃酮。研究證明，白楊素具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗高血壓、抗糖尿病、抗菌、抗過敏等多種藥理作用[4]。本研究旨在探討新合成的一類膦（磷）酰化白楊素衍生物在體外對白血病細胞的增殖抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 Kasumi-1細胞株、K562細胞株、HL60細胞株、Jurkat細胞株、NB4細胞株及U937細胞株購中國科學院上海細胞庫，白楊素含膦（磷）衍生物由中山大學化學與化學工程學院彭愛云提供。PRMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，新生牛血清從杭州四季青生物工程材料有限公司購買，甲基亞砜（DMSO）購自美國Amresco公司。

1.2 白楊素含膦（磷）衍生物的合成 以白楊素為先導化合物，按步驟1和步驟2所示的合成路線（圖1），經(jīng)膦（磷）酰化結(jié)構(gòu)修飾后合成新的系列白楊素含膦（磷）衍生物。結(jié)構(gòu)經(jīng)核磁、紅外、質(zhì)譜等確證，純度經(jīng)高效液相色譜鑒定。化合物合成由中山大學化學與化學工程學院合成。

1.3 細胞培養(yǎng)及原代細胞分離 細胞株用含10%小牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，加1×105 U/L青霉素、1×105 U/L鏈霉素，在37 ℃、95%飽和濕度和5% CO2條件下培養(yǎng)，1～2 d換液1次。

選取根據(jù)MIC分型診斷為急性白血病的初診患者，抽取骨髓5 mL，分離單個核細胞（BMMNCs）。共分離10例急性白血病患者的BMMNCs。

1.4 MTT實驗 取指數(shù)生長期細胞或BMMNCs，實驗在96孔培養(yǎng)板中進行，每孔加入100 μL細胞懸液（2×104個細胞），100 μL用培養(yǎng)基稀釋的藥物。白楊素為陽性對照組、設(shè)溶媒對照組及調(diào)零組，每組3孔，培養(yǎng)一定時間后，實驗組及對照組每孔加入20 μL MTT液（5 g/L），調(diào)零組加入無血清PRMI-1640培養(yǎng)基，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，離心去清液，每孔加入100 μL DMSO溶液，EX-800型酶標儀以450 nm波長測定OD值，計算相對細胞活力，細胞活力（%）=實驗組OD值/對照組OD值×100%，重復3次實驗。

圖1 白楊素含膦（磷）衍生物的合成

1.5 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 11.5軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料數(shù)據(jù)以（x±s）表示，采用t檢驗，P

2 結(jié)果

2.1 白楊素含膦（磷）衍生物的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì) 合成了12個白楊素膦酸單酯（3aC3l），6個白楊素膦酸（4aC4f），1個白楊素膦（磷）酸6和2個白楊素膦（磷）酸單酯7a，7b，共21個化合物。結(jié)構(gòu)見圖2。該類化合物是未見文獻報道的新化合物，其構(gòu)效關(guān)系顯示有更強的抗腫瘤活性、較好的水溶性、更高的生物利用度，其結(jié)構(gòu)經(jīng)核磁、紅外、質(zhì)譜等確證，純度經(jīng)高效液相色譜鑒定，均達到99.5%以上，溶解度經(jīng)高效液相色譜法測定為52.3-138.6 μm。

圖2 白楊素含膦（磷）衍生物

2.2 白楊素含膦（磷）衍生物對Kasumi-1細胞增殖抑制活性篩選 為了篩選出增殖抑制活性較強的化合物，參照文獻[5]報道先導化合物――白楊素抑制細胞活性的有效濃度，并以其作為陽性對照，12個化合物分別以100 μm作用細胞48 h，MTT試驗檢測細胞活性。結(jié)果見表1，衍生物3c、3e、3j、4b、7a、7b對Kasumi-1細胞有一定的增殖抑制活性。其中衍生物3c、7b對細胞的抑制活性遠遠高于先導化合物白楊素，比較差異有統(tǒng)計學意義（P

表1 白楊素膦（磷）酸衍生物對Kasumi-1細胞的增殖抑制率

化合物 增殖抑制率（%） 化合物 增殖抑制率（%）

3a 0.52±12.6 3l 3.19±13.43

3b -5.68±9.52 4a 16.40±13.17

3c 82.64±4.08 4b 36.09±6.48

3d 7.83±7.81 4c 9.25±17.13

3e 46.36±15.96 4d 1.74±6.39

3f 1.62±5.71 4e 0.08±8.64

3g 10.46±13.19 4f -6.99±13.36

3h 15.24±19.41 6 9.09±8.93

3i 16.42±7.95 7a 79.23±5.01

3j 42.89±7.93 7b 31.97±14.61

3k 8.07±14.65 Chrysin 47.39±6.03

以白楊素（chrysin）為對照，100 μm的3c、7a分別作用Kasumi-1細胞0、12、24、36、48、60 h，結(jié)果見圖3。100 μm的3c作用36 h細胞活性最低，100 μm的7a作用48 h細胞活性最低。衍生物3c、7a對Kasumi-1細胞增殖抑制活性呈時間依賴性，且均強于白楊素，比較差異有統(tǒng)計學意義（P

圖3 白楊素含膦（磷）衍生物3c、7a對Kasumi-1細胞增殖抑制的時效關(guān)系曲線

2.3 白楊素含膦（磷）衍生物3c、7a對多個白血病細胞株的增殖抑制活性 為了探討衍生物3c、7a對其他白血病細胞株的活性，選用衍生物3c、7a對Kasumi-1細胞株有效作用時間及濃度，分別作用于Jurkat細胞株、NB4細胞株、K562細胞株、HL60細胞株及U937細胞株，MTT法檢測細胞活性。結(jié)果見圖5、圖6。衍生物3c、7a對以上細胞株的增殖均有明顯的抑制作用，且呈時間及濃度依賴性。與對照組比較，作用時間48 h時，25 μm衍生物3c即對U937細胞產(chǎn)生明顯的增殖抑制作用；50 μm濃度時對Jurkat細胞株、NB4細胞株、K562細胞株及HL60細胞株有明顯的增殖抑制作用，差異具有統(tǒng)計學意義（P

2.4 白楊素含膦（磷）衍生物3c、7a對AML患者BMMNCs的增殖抑制作用 10例初診的急性白血病，其中M2a 4例，M5 1例，B-ALL 2例，T-ALL 2例，慢粒急變1例，分離骨髓單個核細胞，用不同濃度的白楊素含膦（磷）衍生物3c或7a處理48 h，取10例患者各濃度的OD值平均數(shù)做曲線，結(jié)果見圖7。與細胞株結(jié)果類似，衍生物3c及7a對急性白血病患者的骨髓原代細胞均有明顯的增殖抑制作用，且為濃度依賴性。

3 討論

許多研究者對從植物中篩選出的天然黃酮類化合物（如葛根總黃酮、姜黃素、金蓮花黃酮、染料木黃酮等）進行了廣泛研究，發(fā)現(xiàn)其在體內(nèi)外對多種白血病細胞均有一定的活性[6-7]，但是天然黃酮存在活性偏低、類藥性差等缺點。為了提高其抗腫瘤活性，適應臨床應用，各種各樣的黃酮衍生物被合成[8-9]。文獻報道最成熟的為國外研究者合成的Flavopiridol（夫拉平度，黃酮 L86-8275），Ⅰ期或Ⅱ期臨床試驗已證實此藥單用或與其他化療藥物合用對難治復發(fā)性急性或慢性白血病均有肯定療效[6，10]。

圖5 白楊素含膦（磷）衍生物3c對各細胞株的增殖抑制活性

注：A：0、25、50、75、100 μm的3c作用各細胞株48 h；B：100 μm的3c、作用各細胞株0、12、24、36、48、60 h

圖6 白楊素含膦（磷）衍生物7a對各細胞株的增殖抑制活性

注：A：0、25、50、75、100 μ的7a作用各細胞株48 h；B：100 μm的7a、作用各個細胞株0、12、24、36、48、60 h

近年來許多國內(nèi)外學者對白楊素衍生物的合成方法和生理活性進行了研究，對白楊素進行硝化、烷基化、羥甲基化、氟甲基化、膦（磷）酰化后合成的部分衍生物具有較強的抗腫瘤活性，在體外對許多腫瘤細胞都有明顯的增殖抑制作用，如人胃癌SGC-7901 細胞、人肺癌A549 細胞、人肝癌HepG2細胞及HepB3細胞、人宮頸癌HeLa細胞、人鼻咽癌CNE-2細胞、人結(jié)腸癌（HT-29）細胞、人類小細胞肺癌NCI2H446細胞、人急性粒細胞性白血病HL-60細胞、人急性T淋巴細胞白血病Jurkat 細胞、急性白血病（M5）U937細胞等[5，11-13]。白楊素膦（磷）酰化結(jié)構(gòu)修飾的報道較少，陳曉嵐等[14]對白楊素進行了含膦（磷）改造，共合成出4種新的化合物，他們的研究結(jié)果表明，白楊素含膦（磷）衍生物與溶菌酶具有更強的親和力。張婷等[15]合成了白楊素四乙基二膦（磷）酸酯，并發(fā)現(xiàn)白楊素和白楊素四乙基二膦（磷）酸酯對宮頸癌Hela細胞軟瓊脂的集落形成有明顯抑制作用，能誘導并促進宮頸癌Hela細胞發(fā)生分化，且白楊素四乙基二膦（磷）酸酯在作用效果方面較白楊素明顯，該研究提示膦（磷）酸基團的添加增強了抗腫瘤活性。

筆者通過化學法，將膦酸或膦（磷）酸基團引入到白楊素側(cè)鏈中，新合成21個未見文獻報道的白楊素含膦（磷）衍生物。這些白楊素含膦（磷）衍生物具備以下優(yōu)點：（1）它們較白楊素具有更好的水溶性。預期在體內(nèi)能較好的被吸收，可以彌補大多數(shù)天然黃酮因水溶性較差而導致生物利用率低的不足。（2）含膦（磷）基團是一些抗骨質(zhì)疏松、抗病毒、抗腫瘤等藥物分子的藥效團，白楊素又具有廣泛生物活性，所合成的白楊素含膦（磷）衍生物應用了藥效團拼合原理，可能具有更好的藥理活性。通過體外細胞增殖抑制試驗，從新合成的白楊素含膦（磷）衍生物中篩選出對急性白血病（M2）細胞株Kasumi-1增殖抑制作用較強的2個衍生物（3c、7a），這兩個化合物100 μm濃度作用48 h對白血病細胞的增殖抑制率分別為82.64%、79.23%，白楊素同等條件下對白血病細胞的抑制率為47.39%。此后，用衍生物3c及7a分別處理多個細胞株及急性白血病患者的骨髓原代細胞，發(fā)現(xiàn)，白楊素含膦（磷）衍生物3c及7a對檢測的多個白血病細胞株及患者骨髓原代細胞均有明顯的增值抑制作用，說明該兩個衍生物有體外抗白血病活性，有進一步進行體內(nèi)抗腫瘤活性研究的價值。

參考文獻

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篇4

目的 探討萊菔子水溶性生物堿對ApoE基因敲除小鼠內(nèi)皮細胞抗氧化保護作用。方法 將50只ApoE基因敲除小鼠隨機分為5組：模型組、萊菔子水溶性生物堿高、中、低劑量組、血脂康組，每組10只；另取10只C57BL/6J作為空白組。8 w后，眼球取血處死，隨機選取6個樣本檢測指標。結(jié)果 與模型組相比，萊菔子各劑量組均能明顯提高ApoE基因敲除小鼠血清NO含量(P＜0.05)；提高血清SOD的活性（P＜0.05）；降低血清MDA（P＜0.01）含量。結(jié)論 萊菔子水溶性生物堿通過提高ApoE基因敲除小鼠血清NO含量、提高SOD活性、降低MDA含量，發(fā)揮抗氧化作用，從而保護內(nèi)皮細胞。

【關(guān)鍵詞】 萊菔子水溶性生物堿；ApoE基因敲除小鼠；抗氧化

萊菔子是十字花科植物蘿卜(Raphanus sativus L.)的干燥成熟種子，在《日華子本草》中記為蘿卜子。其性味辛、甘、平，歸肺、脾、胃經(jīng)，主要功效為降氣化痰，消食除脹。《本草綱目》記載：“萊菔子長于利氣”。萊菔子水溶性生物堿以芥子堿(Sinapine)為主要成分，廣泛存在于十字花科植物中的一種季胺鹽物質(zhì)。本實驗通過觀察萊菔子水溶性生物堿對載脂蛋白E（ApoE）基因敲除小鼠血清一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)影響來探討萊菔子水溶性生物堿抗動脈粥樣硬化（AS）作用的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥品制備

萊菔子水溶性生物堿，由吉林省中醫(yī)中藥研究院新藥中心制備。

1.1.2 實驗動物

北京維通利華公司提供雄性ApoE基因敲除小鼠75只，雄性C57BL/6J小鼠15只，13周齡，體重（22±2）g，清潔級。

1.1.3 主要儀器及試劑

電子記重秤AWH（SI）-2.5 kg：國產(chǎn)；BD/BC518 -20℃冰箱：國產(chǎn)；4℃冰箱：國產(chǎn)；Q/IFGM0182000低溫高速離心機：德國；HH·W21·600電熱恒溫水浴箱，小型臺式離心機：上海醫(yī)療器械廠；PERLONG；pus2018 半自動生化分析儀：北京普朗新技術(shù)有限公司。

1.1.4 基礎(chǔ)飼料

玉米粉26.0％，面粉29.0％，豆粕28.0％，磷酸氫鈣1.4％，石粉1.6％，魚粉5.0％，骨粉5.0％，鹽1.0％，多種維生素1.5％，多種微量元素1.5％。

1.1.5 肥甘飼料

由10.0%豬油，2.0%膽固醇，20.0％蔗糖，5.0%蛋黃粉，0.2%膽鹽，0.2%甲基硫氧嘧啶，62.6%基礎(chǔ)飼料配制而成。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥

將ApoE基因敲除小鼠（高脂飲食）隨機分為5組，每組15只。模型組，每日灌服飲用水；萊菔子水溶性生物堿高劑量組90 mg·kg-1·d-1，萊中劑量組60 mg·kg-1·d-1，低劑量組30 mg·kg-1·d-1(分別相當于生藥60、40、20 g/kg)，血脂康組0.2 g·kg-1·d-1，另取10只C57BL/6J大鼠作為空白對照組。空白對照組及模型組給等體積蒸餾水灌胃。給藥時間為8 w。

1.2.2 樣本的采集及檢測

給藥8 w后，于末次給藥后摘眼球取血處死動物。分離血清后，隨機選取6個樣本進行檢測。NO試劑盒、SOD試劑盒、MDA試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 統(tǒng)計學方法

運用SPSS13.0軟件進行計算，實驗數(shù)據(jù)均采用x±s表示，組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

治療8 w后，各組小鼠血清NO、SOD及MDA變化比較，見表1。表1 各組治療8 w后各項指標變化比較(略)

3 討論

在AS的發(fā)生發(fā)展過程中伴隨著機體氧化應激反應增強，氧自由基(OFR)產(chǎn)生增加，而機體具有抗氧化能力的SOD、谷胱苷肽過氧化物酶（GPX）活性及NO含量等明顯降低，即抗氧化酶系的保護作用減低。OFR對血管內(nèi)皮恭能的影響主要表現(xiàn)在〔1〕：①損傷內(nèi)皮依賴的血管擴張。由于O-2滅活NO、GPX缺失等造成血管內(nèi)皮功能障礙。②誘導內(nèi)皮細胞凋亡。內(nèi)皮損傷或暴露于O-2和H2O2誘導的細胞凋亡，以致AS發(fā)生和促凝血狀態(tài)。③誘導內(nèi)皮細胞黏附分子表達。④血管新生。除了對胚胎發(fā)育和創(chuàng)傷修復發(fā)揮生理作用外；在病理方面其可參與內(nèi)皮細胞遷移、增殖和血管形成；此外，還參與血管VSMC的生長，遷移。

NO能夠與脂氧化自由基直接反應而干擾低密度脂蛋白（LDL）的氧化過程，從而阻止氧化LDL（oxLDL）的生成及對內(nèi)皮細胞的破壞。SOD是一種廣泛存在生物體內(nèi)的金屬酶類。以O(shè)2為底物，是清除超氧離子自由基的特效酶類。脂質(zhì)氧化應激的產(chǎn)物為MDA。本實驗結(jié)果表明，各治療組均能增加小鼠血清NO含量；提高血清SOD活性，降低MDA的含量，其調(diào)節(jié)作用隨著劑量的增加而增強，呈劑量依賴性。萊菔子高劑量組

與血脂康組比較無顯著差異。

NO是一種理想的抗AS因子，提高NO濃度可以改善血管內(nèi)皮功能〔2〕。SOD又是清除氧自由基的專一酶，因此，萊菔子水溶性生物堿可能通過這一機制而發(fā)揮抗氧化和保護內(nèi)皮細胞的作用。

參考文獻

篇5

【關(guān)鍵詞】 乳腺癌； 金雀異黃素； 衍生物； 細胞周期

中圖分類號 R737.9 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2013）36-0147-02

金雀異黃素（genistein，GEN）是在大豆中天然存在的異黃酮類物質(zhì)。研究表明，GEN是一種強力的酪氨酸蛋白激酶和拓撲異構(gòu)酶抑制劑，能通過多種途徑在體外顯著抑制多種細胞的生長[1]。但由于其在體內(nèi)很難達到有效的血藥濃度，因而限制其體內(nèi)的抗腫瘤作用的發(fā)揮[2]。為增加GEN體內(nèi)的生物學活性，研究者們試圖對金雀異黃素進行結(jié)構(gòu)改造[3]，以期提高其體內(nèi)抗腫瘤作用。本實驗旨在前期對GEN進行結(jié)構(gòu)改造研究基礎(chǔ)上進一步研究GEN衍生物dFMGEN體內(nèi)外抗乳腺癌MCF-7細胞增殖的作用。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑

金雀異黃素衍生物dFMGEN合成方法詳見參考文獻[4]。金雀異黃素、二甲基亞砜（DMSO）、MTT為Sigma公司產(chǎn)品；PRMI-1640培養(yǎng)基等細胞培養(yǎng)用試劑為Gibco公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞與細胞培養(yǎng) 人乳腺癌細胞MCF-7購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清（FCS），1×105 U/L鏈霉素及1×105 U/L青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 MTT實驗檢測dFMGEN對細胞增殖的影響 按1.5×104/孔的密度接MCF-7細胞種于96孔板，待細胞貼壁后加入20 μl不同濃度dFMGEN，使其終濃度分別為5、10、20、40 μM，GEN對照組為40 μM的GEN，GEN對照組加入相同體積含終濃度為0.1% DMSO的完全培養(yǎng)基，每組設(shè)6個復孔，分別處理24 h或48 h。在培養(yǎng)結(jié)束前4 h每孔加入5 g/L MTT 20 μl，顯示后用酶標儀（EX-800型）在570 nm波長測吸光值（A值）。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞周期及凋亡 收集經(jīng)不同藥物處理的dFMGEN細胞，冷PBS洗2遍，用4 ℃的70%乙醇固定24 h后，經(jīng)碘化丙啶（PI）染色，用流式細胞儀檢測細胞周期分布及凋亡情況。

1.2.4 裸鼠異種移植瘤治療實驗 取雌性Balb/c-nu小鼠20只，4周齡，體重約9～11 g，調(diào)整MCF-7細胞濃度為3×107/ml，按

0.2 ml/只接種于小鼠背部皮下，出現(xiàn)移植瘤后按公式V=W2（短徑）×L（長徑）×0.52計算瘤體積，待移植瘤體積達100 mm3左右時隨機分為5組，即對照組（含0.1% DMSO的PBS）；GEN對照組（GEN 45 mg/kg）；低、中、高劑量dFMGEN組（dFMGEN 5、15、45 mg/kg）。各組均隔日經(jīng)腹腔注射給藥1次，共計10次，末次給藥48 h后脫臼處死小鼠，稱取瘤及肝脾重量。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，進行One-way ANOVA檢驗及t檢驗，P

2 結(jié)果

2.1 dFMGEN對體外培養(yǎng)的MCF-7細胞增殖的影響

采用MTT法檢測不同濃度dFMGEN或GEN對MCF-7細胞生長的影響，dFMGEN能呈時間-劑量依賴性抑制體外培養(yǎng)的人乳腺癌MCF-7細胞增殖，且作用強于母體化合物GEN的GEN對照組（P

2.2 dFMGEN和Genistein對MCF-7細胞周期及凋亡的影響

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果提示，10、40 μM的dFMGEN作用于MCF-7細胞48 h后，其G1期細胞分別為65.6%和81.6%，較空白對照組和40 μM Gen處理組的51.5%和63.4%有明顯提高（P

2.3 dFMGEN對人乳腺癌MCF-7細胞裸鼠異種移植瘤生長的影響

治療模型發(fā)現(xiàn)實驗組裸鼠體重、肝脾重量與對照組比較，dFMGEN對瘤生長大小的影響呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，dFMGEN體內(nèi)抗瘤作用明顯強于GEN對照組（P

3 討論

本研究中，筆者將二氟亞甲基導入GEN后，其抗腫瘤作用明顯增強（P

由于體內(nèi)的生長環(huán)境較復雜，藥物需通過腸系膜的吸收及肝臟的代謝等才能發(fā)揮抗腫瘤作用，這也就導致了一些藥物體內(nèi)外研究結(jié)果不一致[7]。如實驗表明，盡管GEN在體外可抑制乳腺癌細胞的生長，但是對裸鼠的乳腺癌細胞異種移植瘤卻并不能獲得相同的效果，與此相反，由于它在體內(nèi)的吸收效果較差，不能達到體外抑制時的濃度，使得GEN在低濃度時所具有的雌激素樣作用得到發(fā)揮而刺激腫瘤的生長[6]。因此，在本實驗中為了進一步評價dFMGEN的體內(nèi)抗腫瘤效果，筆者成功地建立了人乳腺癌MCF-7細胞裸鼠異種移植瘤模型并對其通過腹腔注射給藥進行體內(nèi)治療試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高劑量dFMGEN處理后在體內(nèi)對腫瘤的抑制率為81.6%，而相同劑量的GEN體內(nèi)抑制率僅為56.4%。其原因可能是將含氟基團引入GEN后，能極大的改善其理化性質(zhì)和生物學活性[8]，而且C-F鍵能大大增加化合物的親脂性，使含氟化合物能夠更易透過組織細胞膜，從而提高含氟化合物在生物體內(nèi)的吸收和轉(zhuǎn)運，進而發(fā)揮更強的體內(nèi)抗腫瘤作用[9]。總之，本研究結(jié)果為開發(fā)新的、具有應用前景的抗乳腺癌新藥提供了理論依據(jù)。

參考文獻

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篇6

【摘要】

目的： 研究不同粒徑磁性納米FeOx在外加磁場作用下對肝癌細胞增殖、凋亡的影響。方法： 采用共沉淀法制備得到不同粒徑FeOx，將不同粒徑FeOx吸附于細胞表面，并加載靜磁場(SMF)及100 Hz交變磁場(EMF)照射。運用CCK8檢測納米粒子吸附后在外加磁場作用下Bel7402細胞增殖情況，運用流式細胞儀檢測細胞凋亡、死亡率及細胞周期變化。結(jié)果： 不同粒徑磁性納米FeOx在SMF照射時間低于72 h時能使Bel7402細胞增殖速度增快，當照射時間大于72 h時，細胞增殖速度未發(fā)生明顯變化但部分細胞發(fā)生凋亡，凋亡率為(3.1±0.78)％。而經(jīng)EMF照射后37 nm FeOx吸附細胞增殖被抑制，細胞周期實驗結(jié)果表明大部分細胞被阻滯在G0/G1期，細胞出現(xiàn)大量死亡與凋亡，凋亡率達到(23.34±3.6)％、死亡率達到(57.24±2.7)％。結(jié)論： 納米粒子未有外加磁場照射時不能對細胞產(chǎn)生明顯的影響，外加SMF照射時，細胞的增殖及DNA代謝未發(fā)生明顯的變化，但細胞發(fā)生凋亡；外加EMF照射時，細胞增殖被抑制并發(fā)生明顯的凋亡及死亡，細胞DNA代謝明顯紊亂，且具有較小粒徑的磁性納米FeOx在EMF作用下對肝癌細胞影響最為顯著。

【關(guān)鍵詞】 磁性納米FeOx； 增殖； 凋亡； DNA周期

［Abstract］Objective: To study the effects of different diameters of nano FeOx powders on proliferation and DNA metabolism of heptomacell lines Bel7402.Methods： Different diameters of nano FeOx powders were utilized to dope the heptomacell lines Bel7402 through the coprecipitation meanings， then cells were exposed by static magnetic field(SMF) and extremely low frequency altering magnetic field(EMF) with 100 Hz. After exposed by external fields， CCK8 kit was used to detect the effects on proliferation of cells caused by nano powders. Apoptosis kit and DNA cycle kit was used to detect the effects caused by nano FeOx of cell apoptosis， death and cell DNA cycle metabolism. Results： Different diameters nano FeOx could not influence the cell at all under SMF exposure but could influence the cells under EMF， when the diameter was 37 nm the highest apoptosis and death ration were (23.34±3.6)％ and (57.24±2.7)%， respectively， and the most of cells were prohibited in G0/G1 period of DNA cycle. Conclusion： nano powders could not influence the cells at all without external magnetic field exposure. Under SMF exposure the proliferation and DNA metabolism of cells absorbing by nano powders were not influenced， but the apoptosis ratio of cells was increased. After exposure by EMF cells absorbing by nano powders could be affected in proliferation， apoptosis and DNA metabolism，furthermore， all the effects were more obvious in the cells absorbing by nano powders with little diameter under EMF exposure.

［Key words］magnetic nano FeOx； proliferation； apoptosis； DNA cycle

磁性納米材料具有良好的磁導向性、較好的生物相容性、生物降解性和活性能基團等特點［1-3］，它可結(jié)合各種功能分子，如酶、抗體、細胞、DNA或RNA等，因而在靶向藥物、控制釋放、酶的固定化、免疫測定、DNA和細胞的分離與分類等領(lǐng)域可望有廣泛的應用。磁性納米材料特別是Fe屬納米顆粒已經(jīng)被廣泛應用于藥物靶向治療及干細胞定向移植治療中［4］。當粒徑在30～200 nm之間時，矯頑力和飽和磁化強度均達到最大值，且具有單疇特性。目前已有納米磁性氧化鐵等顆粒作為藥物或干細胞載體用于肝癌動物實驗的研究，但對磁性納米氧化鐵粒子本體對人體研究相對較少［5］。本研究以肝癌細胞Bel7402為對象，觀察不同粒徑磁性納米FeOx在外加磁場作用下對其生物學特性的影響，旨在為FeOx用于治療肝癌提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑及儀器

肝癌細胞株Bel7402購自中國科學院上海細胞庫。靜磁場發(fā)生儀為兩塊強磁場稀有金屬鎳/鐵永磁體，當兩塊磁體間距為2.5 cm時其場強為0.7特斯拉（T）。TYU2002H II型特斯拉計/高斯計為上海亨通磁電科技有限公司產(chǎn)品。變頻儀(FT1000型)為南京萬臣電子有限公司產(chǎn)品，變壓器(PT800型)為上海富濟電子公司產(chǎn)品。胰蛋白酶、Primilar1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自Gibco公司，二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司，維生素C、青霉素、鏈霉素為杭州四季青公司產(chǎn)品。CCK8試劑盒為美國ADL公司產(chǎn)品，細胞凋亡及周期試劑盒均購自美國BD公司。FeSO4、醋酸鋅均為分析純，購自南京化學試劑有限公司。掃描電鏡(SEM)型號為HITACHIX650，X射線衍射儀(XRD)型號為Philips X′pert XRD system型。

1.2 方法

1.2.1 磁性納米FeOx的制備

運用共沉淀法［5］以FeSO4及醋酸鋅為反應物，反應在乙醇、水（1∶3）混合溶劑中進行并加入質(zhì)量百分比為2％的甘油，制備得到醋酸亞鐵前驅(qū)體，前驅(qū)體粉末灼燒溫度為400℃，灼燒4 h后得到FeOx粉體，10 000 r/min離心30 min，得到上下兩層不同粒徑粉末，經(jīng)SEM及XRD實驗確定其粒徑及成分組成。SEM實驗前樣品用超聲清洗儀超聲分散10 min。XRD實驗條件為：掃描速率為2θ/min，測定納米粉體XRD譜。

1.2.2 磁性納米FeOx吸附細胞實驗

將不同粒徑納米FeOx加入到細胞培養(yǎng)瓶中與細胞共同培養(yǎng)。納米粒子吸附細胞方法為：將細胞消化成細胞懸液并調(diào)整細胞濃度大于105個/ml，再將不同粒徑納米粒子加入到細胞懸液中并在恒溫搖床中勻速振蕩30 min，搖床搖速為200 r/min。振蕩完成后將細胞置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)2 d后經(jīng)SEM實驗確定磁性納米FeOx結(jié)合效率。

1.2.3 細胞培養(yǎng)

細胞種植到含10％FBS PIMIRIER 1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶，放置在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱持續(xù)培養(yǎng)。細胞傳代時用胰蛋白酶消化細胞成細胞懸液，磷酸鹽緩沖液（PBS）1 500 r/min 15 min離心洗滌2次，用含10％FBS 1640培養(yǎng)基重懸細胞后種植細胞，每次細胞種植濃度應大于105個/ml。細胞臨時保存在-70℃超低溫冰箱，永久保存在液氮罐中，細胞凍存液配比為DMEM∶FBS∶DMSO=7∶2∶1(體積比)，細胞凍存濃度應高于106個/ml。

1.2.4 磁場照射細胞方法

靜磁場(SMF)照射細胞方法為：將細胞培養(yǎng)瓶置于兩塊永磁體之中，同時置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每間隔12 h照射1次，每次照射30 min，直至84 h。100 Hz交變磁場(EMF)照射細胞方法為：將細胞培養(yǎng)瓶置于離工作線圈頂端2 cm，經(jīng)特斯拉計測量磁感應強度為0.67 mT，每間隔4 h照射1次，每次照射30 min，直至40 h。照射完成后，細胞用胰蛋白酶消化成細胞懸液進行各種檢測。

1.2.5 CCK8細胞增殖實驗

按試劑盒提供實驗方法進行。首先取出96孔酶標板，依照次序?qū)謩e加入50 μl的標準品于酶標板微孔中，分別標記樣品編號，將50 μl細胞培養(yǎng)懸液（2.5×104個/ml）加入到酶標板中；在標準孔和樣品孔中加入100 μl的酶標記液，36℃孵育1 h，將溶液傾出， PBS清洗5次后每孔加入底物A，B液各50 μl，36℃下避光孵育反應15 min后加入終止液50 μl，終止反應。測定450 nm的光密度值。每隔12 h重復進行以上步驟，72 h得到細胞增殖數(shù)據(jù)繪制細胞增殖曲線。

1.2.6 細胞凋亡、死亡及周期實驗

細胞凋亡及周期實驗均在流式細胞儀上完成，均按試劑盒提供實驗方法進行。凋亡實驗方法為：將細胞用胰蛋白酶消化成細胞懸液，并用PBS洗滌2次并將細胞濃度重懸調(diào)整為106個/ml。染色過程為首先用微量移液槍移取20 μl細胞懸液，然后用AnnexinV加入到細胞懸液中并避光靜置15 min后將PI染料加入并靜置30 min，染色完成后上機實驗。細胞周期實驗方法為：首先按凋亡實驗相同方法處理細胞以待上機檢測，染色方法為將試劑盒內(nèi)A，B，C，D 4種試劑按順序分別加入到細胞懸液中，避光靜置時間均為15 min。染色完成后上機實驗。流式細胞儀實驗條件為：細胞進樣流速中速，前向角補償電勢為56 V。

1.2.7 統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果用±s表示，使用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 納米FeOx表征實驗結(jié)果

SEM及XRD實驗結(jié)果表明兩種粒子的平均粒徑分別為37，70 nm左右，粒子形狀為不規(guī)則球形（圖1，2）。根據(jù)Scherrer 公式：D=Kλ/βcosθ，其中D為粒子粒徑，K為形狀因子，λ為X 衍射的波長，β為衍射峰的半峰寬，θ為衍射角。經(jīng)XRD實驗結(jié)果證明粒子中Fe，O兩種元素的比例為1∶1.12。圖3為2種FeOx與Bel7402細胞吸附情況，圖中FeOx為黑色顆粒，F(xiàn)eOx與Bel7402細胞發(fā)生了較為明顯的吸附，37 nm粒子更易于在細胞表面吸附，表現(xiàn)為每個細胞表面吸附粒子數(shù)量明顯增加。

(a)37 nmFeOx(×30 000倍）(b)70 nmFeOx(×10 000倍)

2.2 細胞增殖實驗結(jié)果

不同粒徑納米FeOx在未經(jīng)磁場照射時并未對細胞增殖產(chǎn)生明顯的影響，細胞經(jīng)SMF照射其增殖在磁場照射初期速度變快，當照射時間超過72 h后增殖未發(fā)生明顯改變(相對對照組)。 經(jīng)EMF照射后兩種粒子吸附細胞的增殖均被抑制，當EMF照射時間為5 h時細胞增殖抑制率達到最大，37nm FeOx抑制率達到（76.31±2.3）％，70 nm FeOx抑制率為（53.56±5.2）％。

2.3 細胞凋亡及死亡實驗結(jié)果

從表1可見，凋亡率、死亡率3組間比較差異無統(tǒng)計學意義，說明未經(jīng)磁場照射的納米粒子不能導致細胞死亡及凋亡。表2可見37 nm和70 nm FeOx吸附細胞經(jīng)SMF照射達到60 h后，細胞發(fā)生凋亡，當照射時間為72 h時37 nm FeOx吸附細胞的凋亡率為（3.13±0.78）％，70 nm FeOx吸附細胞的凋亡率僅為（1.25±0.23）％。而未經(jīng)磁場照射37nm FeOx吸附細胞的凋亡率為（0.01±0.03）％，70 nm FeOx吸附細胞的凋亡率為（0.02±0.04）％，未經(jīng)FeOx吸附細胞的凋亡率為（0.01±0.02）％。表1 37 nm和70 nm FeOx吸附細胞自然生長凋亡率及死亡率，Tab 1 Apoptosis and death ration of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx（略）；表2 37 nm和70 nm FeOx吸附細胞經(jīng)SMF照射細胞凋亡率及死亡率，Tab 2 Apoptosis and death ration of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx exposed by SMF（略）。

表3表明隨著EMF照射時間的延長，細胞凋亡率隨之增加，當照射時間達到5 h時其凋亡率最大，37 nm FeOx吸附細胞的凋亡率為（23.34±3.6）％，死亡率（57.24±2.7）％。而70 nm FeOx吸附細胞的凋亡率為（12.54±6.7）％，死亡率為（37.28±4.2）％。當照射時間超過5 h后，細胞凋亡率增速變慢。表3 37 nm和70 nm FeOx吸附細胞經(jīng)EMF照射凋亡率及死亡率，Tab 3 Apoptosis and death ration of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx exposed by EMF（略）

2.4 細胞周期實驗結(jié)果

從表4可見，37 nm和70 nm FeOx吸附細胞自然生長細胞周期，與未經(jīng)處理Bel7402細胞作比較，無統(tǒng)計學意義，與凋亡實驗結(jié)果相符，表明FeOx吸附細胞并不能影響細胞周期代謝。表5表明當細胞被納米粒子吸附并在外加SMF照射下細胞DNA代謝未發(fā)生紊亂，在SMF照射初期細胞處于S，G1期細胞比例增加，細胞增殖變快，與細胞增殖實驗結(jié)果吻合，當照射時間超過72 h后細胞處于G0期含量增加，細胞進入增殖靜止期。凋亡實驗結(jié)果表明此時細胞發(fā)生明顯的凋亡，表明細胞凋亡通路被激活，細胞增殖可能被抑制。表4 37 nm和70 nm FeOx吸附細胞自然增殖細胞周期實驗結(jié)果，Tab 4 Proliferation results of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx（略）；表5 37 nm和70 nm FeOx吸附細胞經(jīng)SMF照射細胞周期實驗結(jié)果，Tab 5 Proliferation results of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx exposed by SMF（略）。

表6表明，37 nm和70 nm FeOx吸附細胞在外加EMF作用下，細胞DNA代謝均發(fā)生明顯變化，細胞周期中G0/G1值增加， 照射5 h時37 nm粒子吸附細胞值為（91.6±1.3）％，而70 nm粒子吸附細胞值為（63.5±2.4）％，細胞增殖被抑制。表6 37 nm和70 nm FeOx吸附細胞經(jīng)EMF照射細胞周期實驗結(jié)果，Tab 6 Proliferation results of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx exposed by EMF（略）。

3 討論

磁性納米材料已經(jīng)被用作藥物或干細胞的載體用于各種疾病的靶向治療［6］，但現(xiàn)有研究多集中于納米粒子與藥物或干細胞的吸附研究，對磁性納米粒子本體在外加磁場作用下對細胞或生物體影響的研究較少，本研究即以磁性納米FeOx在外加磁場作用下對肝癌細胞Bel7402的影響為研究對象。

我們采用共沉淀法制備得到的納米FeOx粒子的平均粒徑分別為37 nm及70 nm且粒徑分布均勻。粒子形狀為不規(guī)則球形，XRD實驗結(jié)果表明粒子的表面有較多的空間位隙，導致粒子中兩種元素的化學計量比不規(guī)則，其Fe與O計量比為1∶1.12。已有研究表明具有晶格缺陷的納米粒子更容易吸附小分子物質(zhì)或更容易吸附在其他物質(zhì)表面［7］，本文合成得到的納米粒子具有較多的晶格缺陷，實驗用納米FeOx較易在細胞表面發(fā)生吸附。

細胞增殖實驗表明，37 nm和70 nm FeOx吸附在細胞表面后在SMF照射條件下，細胞增殖速度在照射初始階段增加，當照射時間超過72 h后細胞發(fā)生凋亡，但增殖速度未發(fā)現(xiàn)明顯變化，可能由于FeOx吸附細胞后在SMF照射條件下更易沉降到細胞培養(yǎng)瓶底部。納米FeOx并不能影響細胞的正常分裂與增殖，同時SMF照射細胞也不能引起細胞發(fā)生改變，與文獻報道結(jié)果類似［8］。EMF照射細胞能抑制細胞增殖，細胞增殖時間明顯延長，當EMF照射時間達到5 h后，EMF照射FeOx吸附細胞抑制達到最大。比較兩種FeOx吸附細胞在EMF照射條件下細胞增殖結(jié)果可以得出，37 nm FeOx粒子對細胞的增殖抑制更為顯著，表明納米FeOx在EMF照射下能很好地抑制肝癌細胞的增殖。

EMF照射細胞本身能影響細胞的增殖，導致細胞早期凋亡以及細胞DNA代謝發(fā)生紊亂和DNA雙鏈斷裂［9］。本研究表明，納米粒子吸附到細胞表面后在外加EMF作用條件下這種影響更為明顯，具有更小粒徑的FeOx在EMF作用下對細胞凋亡的影響更為顯著。同時，隨著EMF照射時間增加，F(xiàn)eOx吸附的細胞DNA代謝發(fā)生紊亂，大部分細胞被阻滯在G0/G1期，同時處于S期的細胞含量減少，表現(xiàn)為明顯的S期和G2 期阻滯。

納米粒子在吸附到細胞表面后可一定限度地改變細胞表面電勢，EMF同樣能改變細胞表面的電勢而導致細胞發(fā)生凋亡等生理現(xiàn)象［9，10］。兩種外加因素對細胞的影響有明顯的疊加效果，納米FeOx在外加EMF作用下發(fā)生明顯的振蕩現(xiàn)象能較大程度改變細胞膜表面的電勢分布，從而改變Na+，K+，Ca2+等離子通過細胞膜表面的速度和方向，Ca2+代謝與細胞的凋亡相關(guān)，Na+，K+與細胞死亡和DNA代謝相關(guān)［10］。同時，納米FeOx在磁場作用下發(fā)生振蕩能導致明顯的熱效應［11］，導致細胞發(fā)生凋亡或死亡以及導致細胞DNA發(fā)生明顯的代謝紊亂。37 nm FeOx在外加EMF作用下對Bel7402的影響更為明顯，在EMF作用下振蕩更為劇烈［12］。

綜上所述，不同粒徑磁性納米FeOx吸附在細胞表面并不能影響細胞的增殖，也不能導致細胞發(fā)生凋亡或DNA代謝紊亂；在SMF照射時，在磁場照射初期能提高吸附有納米粒子的細胞增殖速率，當照射時間達到72 h時能導致細胞發(fā)生凋亡；在EMF照射時，吸附有納米FeOx細胞的凋亡及死亡率急劇變大，表明磁性納米粒子與EMF對細胞的作用有疊加效果，具有較小粒徑的納米FeOx在EMF作用下對細胞的影響更為劇烈。磁性納米FeOx在外加EMF作用下能很好地抑制細胞的增殖。對納米粒子在細胞表面的吸附率、與細胞的融合以及對細胞膜表面電勢的影響及熱效應還需進行更為深入的研究。

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篇7

[摘要] 目的:探討藤梨根正丁醇提取物對培養(yǎng)的人食管癌Eca-109細胞的生長抑制作用。方法:MTT比色法檢測藤梨根正丁醇提取物在不同濃度(1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml)及不同時間(24 h、48 h、72 h)對Eca-109細胞生長抑制作用， TUNEL法檢測其對癌細胞生長的誘導凋亡效應。結(jié)果:①藤梨根正丁醇提取物對人食管癌Eca-109細胞的生長抑制作用隨著藥物濃度的升高和作用時間的延長而增強。②提取物對瘤細胞有明顯的凋亡效應。結(jié)論:藤梨根正丁醇提取物能有效抑制人食管癌Eca-109細胞生長。

[關(guān)鍵詞] 藤梨根/獼猴桃根；食管腫瘤；抑制；凋亡

Abstract:Objective To evaluate the inhibitory effect of extracts from Actinidia arguta by n-butyl alcohol on human carcinoma of esophagus cells(Eca-109).Methods MTT colormetric assay was used to examine the growth inhibition of extracts from Actinidia arguta by n-butyl alcohol on Eca-109 cells， TUNEL test was performed to observe the apoptosis induced by the extracts (1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml)on Eca-109 cells. Results ① The inhibitory effect of the extracts on Eca-109 cells was increased in a dose-and time-dependent manner. ②The extracts could significantly induce apoptosis of Eca-109 cells. Conclusion The extracts from Actinidia arguta by n-butyl alcohol could effectively inhibit Eca-109 cell growth.

Key words: Tengligen/actinidia arguta; Esophagus tumor; Inhibitory effect; Apoptosis

細胞凋亡是由基因編碼控制的一種細胞的程序性死亡，是機體維持正常生理活動所必需的。近年發(fā)現(xiàn)細胞凋亡在許多疾病尤其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中起著重要作用，這為腫瘤病人的治療提供了新的思路。隨著中醫(yī)藥對腫瘤治療的大量臨床觀察及實驗研究的深入，人們逐漸肯定了它對腫瘤治療方面的療效。其抗腫瘤作用機制有多方面，如抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡，抑制蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）活性等[1-4]。藤梨根又稱陽桃根，為植物獼猴桃科藤梨（軟棗獼猴桃）Actinidia arg-uta(Sieb.teZucc.)Planch.或獼猴桃A.chinensis Planch.的根。研究表明，藤梨根對多種腫瘤細胞有生長抑制作用，采用不同方法所得的提取物其抑制作用存在一定的差異[5-6]。本文通過觀察藤梨根對培養(yǎng)的人食管癌Eca-109細胞生長的作用，以探討藤梨根對人食管癌細胞的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料人食管癌細胞Eca-109細胞株購于上海市中科院細胞庫，RPMI-1640培養(yǎng)基購于武漢天源生物技術(shù)有限公司，為Gibco公司產(chǎn)品(貨號31800-022)；超級新生牛血清為杭州四季青生物工程有限公司產(chǎn)品(批號050126)；實驗用1∶250胰酶購于武漢天源生物技術(shù)有限公司，為Difco公司產(chǎn)品(批號020411)；四甲基偶氫唑藍(MTT) 購于武漢天源生物技術(shù)有限公司，為Duchefa分裝(貨號BS0880)；二甲亞砜(DMSO) 購于武漢天源生物技術(shù)有限公司，為Sigma公司產(chǎn)品。TUNEL試劑盒(編號ZK-8005) 購于北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)細胞在含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，24 h換液一次。

1.3 藥物制備將藤梨根1 kg粉碎成粗粉，烘干備用。取藤梨根500 g，加入3 000 ml正丁醇中浸泡12 h；回流提取1 h，過濾；藥渣再加2 000 ml正丁醇回流提取1 h；合并兩次濾液，減壓回收正丁醇至稠膏狀，真空干燥；干燥品加蒸餾水500 ml，旋轉(zhuǎn)加熱溶解，制成飽和水溶液；滅菌；原液(500 ml，1 g/ml，pH=3.8)。將原液稀釋成1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml三個藥物濃度；過濾；滅菌；分裝，置4 ℃冰箱備用。

1.4 MTT法將貼壁細胞用0.25%的胰蛋白酶消化后計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為4×104/ml，接種于96孔板，待24 h細胞貼壁后加入藤梨根正丁醇提取物藥液。實驗組分別加入終濃度為1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml 3個藥物濃度的藥液，對照組加入等體積溶劑的培養(yǎng)液，每組l2復孔，分別于加藥后第1、2、3 d測定各孔的吸光度值(A值)。測定前每孔加5 mg/ml的MTT 20 μl，溫育4 h，棄上清液，加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl /孔。同時振蕩至結(jié)晶完全溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長下測定A490值。用各組的平均A值計算細胞生長抑制率。生長抑制率=（對照組A值－實驗組A值）/對照組A值×100%。

1.5 TUNEL法檢測凋亡細胞將濃度為4×104/ml的Eca-109細胞接種于經(jīng)多聚賴氨酸包被的干凈蓋玻片上，用RPMI 1640培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2條件下在24孔板中培養(yǎng)24 h后取出蓋玻片，PBS沖洗3次。0.1%Triton-100破膜、4%多聚甲醛固定，H2O2阻斷。用TDT法將生物素標記的d-UTP在末端轉(zhuǎn)移酶的作用下，標記到DNA的5′端缺口上，再用親和素標記的HRP與之結(jié)合，然后加入底物DAB顯色，蘇木素復染，從而使凋亡細胞核呈現(xiàn)棕褐色，未凋亡細胞核呈藍色。在光學顯微鏡下隨機計數(shù)5個高倍視野約1 000個細胞中的凋亡細胞數(shù)， 計算凋亡細胞所占比例。

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2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測生長抑制率結(jié)果表明藤梨根正丁醇提取物對人食管癌Eca-109細胞的生長抑制作用隨著藥物濃度的升高和作用時間的延長而增強。用1 μg/ml的正丁醇提取物作用24 h，細胞生長抑制率為18.5%；當延長至72 h時，抑制率上升至45.3%；而100 μg/ml的藥物作用72 h時，可使85%以上的細胞生長受到抑制（見表1）。

表1 藤梨根正丁醇提取物對Eca-109細胞的生長抑制率（略）

2.3 TUNEL法檢測細胞凋亡當用1 μg/ml藤梨根正丁醇提取物處理Eca-109細胞24 h時，可檢測到形態(tài)尚未發(fā)生改變的早期凋亡細胞；當藥物作用時間延長至72 h時，可見凋亡細胞變圓，體積明顯縮小，核染色質(zhì)濃縮，變成新月形，此為晚期凋亡細胞，隨時間的推移，凋亡細胞比例逐漸增加（見圖1）。而對照組，未見有明顯凋亡現(xiàn)象（見圖2）。

3 討論

腫瘤是危及人類生命的首要頑疾，藥物治療為中西醫(yī)腫瘤治療中的一個重要模式，包括化學藥物和天然藥物。中醫(yī)藥的抗腫瘤作用已得到廣泛的肯定，其機制有多方面，如抑制DNA合成、抑制腫瘤血管形成、誘導細胞分化、促進細胞凋亡、調(diào)節(jié)機體免疫功能、抑制蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）活性等[1-4]。關(guān)于藤梨根的研究已有報道，其對消化系統(tǒng)腫瘤有良好的抗腫瘤作用，可用于消化系統(tǒng)腫瘤的治療[5]，但其抗腫瘤作用機制還不清楚。初步研究發(fā)現(xiàn)，同種獼猴桃根不同提取方法所得的提取物其抗腫瘤作用可能不盡相同。有學者用甲醇、水、乙酸乙酯、正丁醇等溶劑回流提取， 觀察提取物對同種肝癌細胞株的作用， 結(jié)果表明正丁醇、乙酸乙酯提取物對瘤細胞的生長有較好的抑制作用， 但各組量效關(guān)系不明顯[6]。關(guān)于藤梨根提取物中抗腫瘤作用的成分， 曾有人報道主要為三萜類化合物， 分別為乙酸乙酯提取物熊果酸、β-谷甾醇及正丁醇提取物2α，3α，24-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸、2β，3β，23-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸、24-hydroxytormentric acid[7]。研究表明，藤梨根對多種腫瘤細胞生長均有抑制作用。鐘振國[8]等采用MTT比色法、集落形成法等方法對藤梨根作用的宮頸癌細胞株Hela、神經(jīng)腫瘤細胞株NG108-15、胃癌細胞株SGC7901等進行了研究，結(jié)果藤梨根對不同瘤細胞的生長均有不同程度的抑制作用。李昊[9]等研究了藤梨根對人胃低分化腺癌BGC-823細胞的作用，發(fā)現(xiàn)其濃度在1.3 mg/ml時抑瘤率最強(88.19%)，隨著藥物濃度的降低，抑瘤率隨之下降；藤梨根對胃癌細胞作用24 h抑制作用最強(87.6l%)，48 h回落，72 h再次上升， 其對胃癌細胞有明顯殺傷作用。衛(wèi)培峰[10]等在動物實驗中證明藤梨根能有效誘導鼠胃癌細胞的凋亡， 與對照組細胞的凋亡率和死亡率有顯著的差異。 近幾年來，國內(nèi)外對細胞間隙連接通訊與癌變的關(guān)系進行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)多數(shù)腫瘤細胞無此功能，其間隙連接少或無，而鄰近的正常組織或良性腫瘤的間隙連接正常，少數(shù)腫瘤細胞有脆弱的連接通訊，但很容易受到破壞，其間隙連接數(shù)量很少，藤梨根可以通過上調(diào)細胞間隙連接通訊功能來抑制某些腫瘤細胞如高轉(zhuǎn)移性人肺癌細胞的生長[11]。本研究結(jié)果證實：藤梨根正丁醇提取物三個藥物濃度1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml作用于Eca-109細胞24 h、48 h、72 h后，顯示出明顯的凋亡特征。TUNEL法可檢測到不同時期的凋亡細胞；MTT法也發(fā)現(xiàn)隨藥物濃度升高和作用時間的延長，其抑制率明顯升高。因此推測，誘導腫瘤細胞凋亡可能是藤梨根抗腫瘤作用的機制之一。但細胞凋亡的調(diào)控及信號傳導極其復雜，有多種分子參與。故抗腫瘤作用的真正機理及體內(nèi)抑瘤實驗尚需進一步深入研究。

(文中圖1~2見封四)（略）

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篇8

1、細胞結(jié)構(gòu)：在充分基礎(chǔ)教學的基礎(chǔ)上，制作細胞模型，一般可以采用不同顏色的橡皮泥制作成不同的形狀，代表不同的細胞器，但是要考慮到合理性和科學性；

2、分子結(jié)構(gòu)模型：DNA和細胞膜的流動鑲嵌模型，可以利用不同大小的小球進行科學組裝后，進行展示，既能掌握其物理結(jié)構(gòu)，又能提供深入學習的可能。

注意：生物模型的制作是教學的重要一環(huán)，必須考慮其合理性和科學性，引導學生善于發(fā)問，及時解決制作過程中的問題。充分發(fā)揮學生的主觀能動性，豐富教學環(huán)節(jié)。有條件的學校和家庭還可以利用網(wǎng)絡(luò)制作電子版的三維模型。

（來源：文章屋網(wǎng) ）