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【中圖分類號】R691【文獻標識碼】A【文章編號】1007-8517(2009)10-0125-01
壓力性尿失禁(SUI)為女性的常見病和多發病，其發病率約為1 S%-6O%，多發生于老年人，因受經濟、宗教、教育程度等因素的影響，其實際發生率比統計發病率更高。SVl的癥狀嚴重與否都不自接危及生命，但它給患者的日常上作、生活及社交活動造成一定程度的影響，甚至會嚴重影響患者的生活質量乃至家庭和睦。
1臨床資料
注射療法是將藥物、化學制劑或自體組織等注入后尿道或膀肌頸內口粘膜下，使尿道腔變窄、拉長，延長功能性尿道的長度，提高尿道阻力，起到關閉尿道內口和后尿道的作用，從而達到有效控制排尿的口的。這一治療方法對尿道內括約肌功能障礙、尿道內壓降低同時尿道、膀肌無其他病變等壓力性尿失禁患者有較好的效果。注射療法主要優點在于.以在局部浸潤麻醉下進行操作，大多數患者的手術均.IJ.以在門診進行，適用于老年及不能耐一受大手術的患者。口前注射療法的研究主要集中在選擇不同的注射材料上，理想的注射材料應該在結構上完整，無毒、無免疫原性、無變應原性，近期內不會被分解，能長時間保持其支撐作用。口前使用的材料尚難達到上述要求，因此尋找一種取材方便、生物相容性好、安全無毒、療效滿意的注射材料十分必要。
方法：無菌技術下獲取SD大鼠雙側腹股溝區脂肪墊，消化離心，長期培養的方法獲取脂肪源性間充質干細胞。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態變化，對培養細胞進行免疫細胞化學染色，鑒定其表面分子標志。SD大鼠24只分為3組，實驗組（6只），對照組一（3只），對照組二（3只）。分別獲取自體ADSCs，實驗組進行熒光標記。然后實驗組將熒光標記的ADSCs自體移植至尿道周圍，對照組移植未并取尿道組織進行HE染色組織學分析。
2結果
原代培養顯示培養的脂肪源性間充質干細胞2d左右開始壁,10d-14d左右可達90%融合,基本上為梭形成纖維樣細胞形態,免疫細胞化學示 CD29陽性，CD34陰性。神經切斷術后10天，除模型組和對照組一各有1只大鼠死亡外，均進行尿流動力學檢測，三組手術前后ALLP分別為：對照組一為27.1±5.1和29.1±3.2cmH2O，對照二為29.5±4.9和27.4±72.3,模型組為24.8±3.8和14.7±3.0。模型組手術后ALLP明顯降低，且組織學檢查亦證明模型組大鼠尿道周圍括約肌明顯萎縮。
3討論
本實驗將熒光金標記的脂肪源性干細胞自體移植至大鼠的近端尿道周圍，行冰凍切片，組織化學染色，熒光顯微鏡下觀察.見熒光標記的細胞呈金黃色:后取組抗體免疫移植部位有較多的Desmin陽性的細胞，棕黃色，部分出現一定的方向性，未見明顯炎癥細胞浸潤，說明己有細胞在局部存活并生長，提示能成為壓力性尿失禁注射治療的一種理想的注射材料，為將來進行細胞移植治療壓力性尿失禁提供了實驗依據。
結論：①大鼠脂肪組織中含有豐富的多能干細胞。利用消化離心，長期培養的方法可獲取大量的干細胞。②移植后大鼠的ADSCs，可以在尿道周圍成活并生長分化。
參考文獻
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【摘要】
目的： 建立胎鼠大腦皮層神經干細胞體外分離、培養、分化及鑒定的方法，探討神經干細胞的基本生物學特性。方法： 取孕14 d胎鼠大腦皮層，吸管吹打機械分離制成單細胞懸液，采用無血清培養和胎牛血清誘導分化， 應用免疫熒光技術鑒定神經干細胞及其分化的子代細胞。結果： 從胎鼠大腦皮層分離的細胞呈神經巢蛋白（Nestin）免疫陽性并能在體外傳代培養，血清誘導分化后的細胞可表達神經元、星形膠質細胞的特異性抗原微管相關蛋白2和膠質纖維酸性蛋白，誘導分化成的神經元能表達突觸的特異性標志Synatophymin。結論： 分離和培養的細胞能表達神經干細胞的特異性標志物Nestin，并且具有很強的增殖能力和多向分化潛能，屬于中樞神經系統的神經干細胞。
【關鍵詞】 干細胞 大腦皮質 細胞培養 細胞分化 胚胎 大鼠 Sprague Dawley
［Abstract］ Objective: To establish a method for isolation， cultivation， differentiation induction， and identification of neural stem cells (NSCs) from embryonic rat in vitro， and explore the basic biological features of these cells. Methods： The mesencephalon of rat with conceptus age of 13 days was taken out and dissociated into single cell suspension mechanically， and then cultured in serumfree medium. Fetal bovine serum was used to induce cell differentiation. The isolated cells and their progeny were observed by using immunofluorescence technique. Result： The isolated cells showed nestin positive reaction and could be cultured in vitro in series. After being induced by fetal bovine serum， microtubuleassociated protein 2 (MAP2) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) which are specific antigens in neuron and astrocyte expressed in these cells， and synatophymin， a specific signal of synapse， was also expressed in the differentiated neurons. Conclusion： The isolated and cultured cells are NSCs of central nervous system， and possess strong capability of proliferation and potency of multidirectional differentiation.
［Key words］ stem cells; cerebral cortex; cell culture; cell differentiation; embryo; rats， spraguedawley
傳統觀念認為，哺乳動物的神經組織只有死亡，沒有再生能力。自從上世紀90年代初科學家們分離、培養出神經干細胞(Neural stem cells，NSCs）以來，人們相繼從各種動物及人的中樞神經系統分離、培養了NSCs[1，2] 。NSCs的發現不僅打破了神經元不會再生的傳統觀念，而且為許多以往難以治療的神經系統疾病提供了新的治療思路和途徑。2007年6月利用細胞分離、無血清培養、血清誘導分化及免疫熒光等技術，證明了本實驗所分離的細胞群為NSCs，以期為進一步使用和研究NSCs奠定理論及實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
DMEM/F12、B27、胎牛血清購自GIBCO公司，bFGF、Nestin抗體、突觸素抗體Snaptophysin購自SIGMA公司，MAP2抗體、GFAP抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司，倒置相差顯微鏡及熒光顯微鏡為NIKON公司產品。
1.2 NSCs的分離培養[3～5]
成年雌性和雄性SD大鼠各1只，體重220～260 g，雌雄合籠后，檢查陰栓，見陰栓計為孕0 d；孕14 d時取胎鼠，在解剖顯微鏡下仔細分離獲得胎鼠大腦皮層，再用DHanks液漂洗，用眼科剪反復切割組織，再用200目細胞篩過濾，收集入離心管中，反復吹打，制成單細胞懸液，經細胞計數后，分裝入50 ml培養瓶中，細胞數約為1×106/ml。培養條件: DMEM/F12 6 ml+B27120 μl + bFGF12 μ1，37 ℃， 5%CO2; 每6～7 d傳代1次。
1.3 NSCs的誘導分化
取第4代傳代培養的NSCs，將其吹打成單細胞后，以5×104/片細胞密度種于經0.1%多聚賴氨酸處理過的蓋玻片上，培養條件為: DMEM/F121.5 ml + B2730 μl + FBS 150 μl， 37 ℃，5%CO2，培養7 d。
1.4 免疫熒光單標法鑒定NSCs及其子代細胞
1.4.1 Nestin免疫反應陽性細胞
將懸浮培養的細胞團用4 %多聚甲醛固定30 min后涂在載玻片上，37 ℃烘干，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，加入一抗Nestin（1∶100）后4 ℃過夜，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，加入二抗兔抗羊TRITC(1∶100)后37 ℃孵育1 h，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，熒光顯微鏡下觀察。
1.4.2 MAP2 、GFAP、Snaptophymin免疫反應陽性細胞
取誘導分化的NSCs的細胞蓋玻片用4%多聚甲醛固定30 min，37 ℃烘干，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，分別加入一抗MAP2（1∶100）、GFAP（1∶100）和Snaptophysin（1∶100）后4 ℃過夜，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，分別加入二抗羊抗兔FITC(1∶100)和羊抗兔Cy3(1∶100)后37 ℃孵育1 h，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，熒光顯微鏡下觀察。
2 結果
2.1 NSCs的形態學特征及鑒定
由孕14 d胎鼠大腦皮層分離培養的原代細胞， 接種后立即在相差顯微鏡下觀察，細胞呈懸浮的圓形狀，邊界清楚，折光性強，絕大部分單個存在。經6～7 d無血清加bFGF培養后，細胞呈球狀集落， 95 %以上的NSCs球呈懸浮生長，細胞增殖旺盛（圖1）。原代培養時，培養瓶中可見一些細胞碎片和一些貼壁的雜細胞，但經傳代后，這些雜質均減少甚至消失，且生長狀態良好。在相差顯微鏡下，NSCs呈球形或橢圓形，大小不一。經Nestin免疫熒光染色鑒定顯示神經干細胞球呈紅色熒光（圖2）。
2.2 NSCs的誘導分化及其鑒定
胎鼠大腦皮層神經干細胞的分離培養、分化及鑒定在NSCs培養液中加入10%胎牛血清3 h后，NSCs球即開始貼壁和分化，6 h后即可明顯發現有突起從團塊邊緣長出，24 h后有少數細胞分化為有突起的細胞，以后分化的細胞逐漸增多，從細胞球周圍遷移出，呈放射狀排列（圖3）；隨著時間的推移，突起不斷增粗與延長并互相連接成網狀，7 d時在相差顯微鏡下NSCs球周圍可見分化成胞體圓形豐滿的神經元樣細胞和突起粗大的膠質細胞樣細胞。免疫熒光染色顯示，在胎牛血清的誘導分化下NSCs能分化成表達各種相應特異性標志的終末細胞，即表達MAP2的神經元（圖4）、表達GFAP的星形膠質細胞（圖5）；同時，從NSCs分化而來的神經元能表達突觸素（圖6）。
3 討論
NSCs是指在哺乳動物中樞神經系統內具有多向分化潛能和自我復制能力的一群細胞，由于具有廣闊的應用前景而受到神經科學領域眾多研究者的關注，在治療惡性膠質瘤、神經系統損傷、中樞神經系統慢性退行性疾病（帕金森病、亨廷頓病）等方面已取得豐碩的成果[6～8]。
NSCs在哺乳動物中樞神經系統內分布非常廣泛，本實驗從大腦皮層取材，采用機械分離法來制備NSCs懸液，實驗效果比較理想。NSCs懸液的制備有酶消化法和機械分離法，但以酶消化法使用居多。由于在實際操作中很難從客觀上準確地把握酶作用的最佳時間點，往往導致消化不足而不易獲得單細胞懸液；或消化過度造成細胞受損而導致細胞活力下降甚至死亡。并且，在NSCs表面具有針對許多神經生長因子的受體[9]，當采用酶消化法來獲取NSCs時， 可能會引起細胞表面受損而致使一部分受體丟失，而這些受體對于NSCs 維持其干細胞的未分化狀態是必需的。所以采用顯微解剖和吸管吹打等機械分離方法來制備NSCs懸液是神經干細胞分離中較為理想的方法。
本實驗發現在原代培養時，培養瓶中可見大量的細胞碎片和一些貼壁的細胞，但經傳代3～5代后，這些雜質逐漸減少甚至消失。這主要是由于培養液中所含的bFGF只對NSCs具有促進分裂和增殖作用[10，11]，而其他雜細胞在該培養液中無法生長。因此，原代細胞中大部分非NSCs會發生死亡，而NSCs不僅可以存活，還可以分裂和增殖，形成神經干細胞球，從而經過多次傳代后， NSCs可以得到純化。
Nestin是神經干細胞的一個標志物，本實驗培養的細胞通過免疫熒光觀察培養的細胞球均呈Nestin免疫反應陽性，提示組成細胞球的細胞為NSCs。當在培養液中加入10％的胎牛血清后，NSCs可以分化為神經元樣細胞和膠質細胞樣細胞。免疫熒光顯示，誘導分化7 d后NSCs可以分化為表達MAP2的神經元和表達GFAP的星形膠質細胞，證明了NSCs具有多向分化潛能。同時，本研究觀察到從NSCs誘導分化成的神經元突起上有分化較好的串珠樣排列的膨體，突觸素免疫熒光染色陽性，顯示其已經具備接受信息的結構基礎，表明分化的神經元能夠合成和運輸神經遞質，行使可能的生理功能[12]。
實驗從孕14 d胎鼠大腦皮層分離培養的細胞團具備NSCs的三大特征：Nestin免疫反應陽性、分裂增殖能力和多向分化潛能，由此證明了所分離培養的細胞是NSCs。并且，由血清誘導分化而來的神經元具備一定的生理功能，可以用于進一步的實驗研究。
參考文獻
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【摘要】
目的 建立Wistar大鼠骨髓間充質干細胞（MSCs）分離、培養的方法，并進行鑒定、標記。方法 采用全骨髓貼壁培養法分離培養大鼠的MSCs。采用相差顯微鏡觀察MSCs的形態學特征；流式細胞儀檢測第3代細胞表面標志抗原CD29、CD44、CD34和CD45的表達率；電鏡檢查第3代MSCs超微結構。DAPI標記MSCs為下一步進行體內細胞移植示蹤。結果 原代培養的MSCs于6～8 h后貼壁，6 d左右形成集落，14 d 左右可達到80%～90%融合。第3代細胞表面標記物CD29，CD44，CD34和CD45的陽性率分別為98.6 %，78.2%，0.0%，0.3%。超微結構清晰，可見細胞器，如線粒體、粗面內質網和高爾基復合體，細胞核呈圓形或不規則，可見較多微絨毛。DAPI可良好標記MSCs細胞核，呈藍色熒光。結論 采用全骨髓貼壁培養的方法能夠成功分離和培養大鼠的MSCs，在第3代可獲得高純度MSCs。DAPI可以作為一種示蹤劑標記MSCs。
【關鍵詞】 細胞培養；間充質干細胞；種子細胞；示蹤劑
【Abstract】 Objective To establish a method for isolation and culture of bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs) from Wistar rats in vitro，and to identify characteristic of the cells and to label them after culture expansion.Methods MSCs were isolated and cultivated from the bone marrow of Wistar rats by adherent method.The morphology of MSCs was observed under phase contrast microscope.The expression of CD29 ， CD44 ， CD34 and CD45 of the third generation cells were analyzed by flow cytometry. Electron microscopic features were also observed and MSCs were labeled by DAPI. Results After 6 to 8 h primary culture ， MSCs adhered to plastic surface of the culture dish. About 6 d later ， the cells proliferated in colonies.Primary MSCs reached 80%～90%of confluence in 14 d approximately.The positive rates of CD29 ， CD44 ， CD34 ， and CD45 in MSCs at third generation were 98.6% ，78.2% ，0.0% ， and 0.3% respectively. Under the electron microscope MSCs had plentiful cytoplasm with mitochondria rough endoplasmic reticula and Golgi complexes.Their nuclei were round or irregular and there were plenty of microvilli on the surface. All of the MSCs after labeling by DAPI showed blue fluorescence by fluoroscope.Conclusions Mesenchymal stem cells can be successfully isolated and cultivated by adherent method.And higher purity MSCs can be picked up after culture expansion at P3. DAPI can be an effective tracer agent to label MSCs.
【Key words】 Cell culture;Mesenchymal stem cells;Seed cells; Tracer agent
骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類具有自我更新和多向分化潛能的非造血干細胞，可以向骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、干細胞、肌細胞、神經細胞以及心肌細胞分化〔1，2〕，具有高度可塑性，易于體外擴增，因其來源充足、取材方便，體外增殖能力相對較強，而且在異體移植中排斥反應小，被認為是組織工程和基因工程的理想種子細胞，為心血管疾病、神經疾病和骨關節疾病的治療提供了一條全新的治療方案。本文在總結貼壁分離法培養MSCs的基礎上，優化MSCs純化、鑒定、標記的方法，以獲得穩定的培養體系，為應用組織工程技術提供大量的種子細胞。
1 材料與方法
1.1 動物
清潔級雄性Wistar大鼠(3周鼠齡，60～70 g)，吉林大學動物實驗中心提供。
1.2 主要試劑和藥品
低糖DMEM培養基(Gibco公司)，特級胎牛血清(Gibco公司)，胰酶(Sigma公司)，亞美尼亞倉鼠抗大鼠CD29Alexa Fluor (Biolegend公司)，小鼠抗大鼠CD45過氧化物酶（FITC）(Biolegend公司)，小鼠抗大鼠CD44PE (Santa Cruz 公司)，小鼠抗大鼠CD34FITC(Santa Cruz公司)，46二脒基2苯基吲哚（DAPI）儲存液(Sigma 公司)。
1.3 分離和培養
Wistar大鼠麻醉后處死，浸泡酒精15 min，無菌條件下分離股骨、脛骨，無血清DMEM沖洗骨髓腔，取混懸液，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀含10%胎牛血清的DMEM混懸，將獲得的細胞接種在100 ml培養瓶中，5% CO2，37℃下培養24～48 h，換液，去除未貼壁細胞，2～3 d更換一次培養基，光鏡觀察細胞融合情況，細胞80%融合后傳代，0.25%胰酶消化，用血球計數儀計數細胞、傳代，培養3～5代細胞。
1.4 透射電鏡樣品制備
將培養3代10 cm2培養皿中約2×106個細胞以磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次，再以3 %戊二醛4℃固定1 h，送電鏡室，脫水包埋并制作超薄切片，行透射電鏡觀察并拍照。
1.5 MSCs表面標記物檢測
0.25%胰酶消化收獲第3代細胞，收集1×106個細胞，洗滌1次，0～4℃預冷的70%乙醇1 ml邊加入邊搖勻，混勻后置于4℃冰箱待進行細胞表面標記物檢測。檢測時以1 ml PBS洗滌2次，加含10%山羊血清的 PBS常溫孵育10 min，1 000 r/min離心5 min去上清，與飽和濃度的CD29Alexa Fluor、CD34FITC、CD44PE、CD45FITC單克隆抗體及其同型對照混勻，室溫下閉光反應30 min，PBS 洗滌細胞，置于冰上，行流式細胞儀檢測。
1.6 MSCs標記
將無菌的DAPI 儲存液加入培養的MSCs爬片上清中，至終濃度為50 mg/L ，37 ℃孵育染色至少30 min。細胞至少用Hanks 平衡鹽溶液沖洗6 遍以除去未結合的DAPI。熒光顯微鏡下觀察細胞爬片。
2 結 果
2.1 MSCs相差顯微鏡觀察細胞形態
骨髓細胞接種于培養瓶后，約6～8 h可見MSCs細胞貼壁，呈圓形或多角形，換液后，貼壁細胞清晰可見，2～3 d后可見少量短梭形、星形細胞分散貼壁生長，伸出偽足呈逗點狀或短棒狀；6 d左右可見放射狀排列的細胞集落，伸出長短不一、粗細不均的突起、胞核大、核仁清晰。約14 d細胞融合80%～90%，呈漩渦狀。傳代細胞比原代細胞貼壁快，24 h內已全部貼壁、伸展，增殖迅速，均勻分布生長，3～4 d可見長梭形細胞80%～90%鋪滿培養皿形成單層。見圖1。
2.3 MSCs的鑒定及標記
第3代細胞表面標記物CD29、CD44、CD34和CD45的陽性率分別為98.6 %、78.2%、0.0%、0.3%。見圖3。細胞經DAPI標記后，細胞核呈藍色。見圖4。
3 討 論
由于骨髓的細胞組成復雜，細胞功能各異，其中MSCs含量很低，約為骨髓低密度組分中有核細胞的0.001%～0.01%〔3〕，故分離高純度的MSCs是原代培養關鍵性技術。目前，獲得MSCs的方法主要有貼壁篩選法、密度梯度離心法、流式細胞儀分離法、免疫磁珠分選法〔4〕。而骨髓貼壁法操作步驟簡單，既降低了離心對細胞的損害，又減少了污染機會，且分離的MSCs貼壁時間短，增殖快，細胞數量多，經傳代后能夠純化，提示全骨髓貼壁法是一種更加簡單有效的MSCs分離方法。
一般認為，間充質干細胞沒有特異性表面抗原，整合素家族成員CD29、黏附分子CD44、CD166、CD105等是MSCs的重要標志物〔5〕，而MSCs不表達造血細胞表面抗原，如造血前體細胞標志抗原CD34、成熟造血細胞標志抗原CD38、白細胞標志抗原CD45、淋巴細胞表面抗原CD11a和單核細胞/巨噬細胞表面抗原CD14。因此，實驗選取MSCs表達陽性的指標CD29、CD44，以及表達陰性的指標CD34和CD45作為鑒定參考指標〔2，6〕。本研究選擇了CD29、CD34、CD44和CD45進行檢測，結果表明培養的細胞CD29和CD44陽性，CD34和CD45陰性，符合MSCs的特點，經過傳代，第三代可獲得較高純度的MSCs，可以作為穩定的種子細胞進行體內研究。
DAPI是一種能夠與DNA強力結合的熒光染料，常用于熒光顯微鏡觀測。DAPI對活細胞無毒性，不改變細胞器的超微結構，熒光保持時間較長。移植細胞的標記是研究其在體內的定位不可缺少的，目前常用的標記法有DAPI標記法、溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）標記法、染色體標記法、基因標記法。BrdU法存在只能標記增殖期細胞，且標記細胞不能直接觀察等不足。染色體標記主要將雄性供體動物細胞移植到雌性動物體內，通過Y染色體雜交區別確認移植細胞。其優點在于可以終生標記，但也存在操作繁瑣，無法觀察活細胞等不足。基因標記法通過基因轉染或直接從轉基因動物取材，使被標記細胞攜帶綠色熒光蛋白（GFP）暼報告基因。但目前，實現報告基因在目的細胞中高效穩定表達仍然存在程序繁瑣、實驗周期長、成功率低等困難，而從轉基因動物取材又因為動物來源困難，在國內較少開展〔7〕。本研究表明，DAPI起初標記率很高(接近100%)，1 w內可維持80%～90%標記率。但隨著標記時間的延長，其標記效率迅速下降，3 w以后絕大多數細胞失去標記。
本實驗完善貼壁法建立Wistar大鼠MSCs培養體系，經鑒定細胞純度高，可以為體內移植提供大量的種子細胞。采用DAPI 進行細胞標記后，熒光顯微鏡下見所有MSCs 均已被標記藍色熒光，提示DAPI 標記法敏感性好，標記效率高，可應用進行體內細胞移植的良好標記。
參考文獻
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關鍵詞：信息技術；婦幼保健院；政工干部培養
信息技術是伴隨計算機和網絡技術的發展而發展的，如今信息技術已經進入了發展的全盛時期，信息技術的發展對人們的生活、學習及工作方式產生了廣泛而深刻的影響。在此背景之下，政工干部的培養工作也不免受到信息技術發展的影響，如何準確地把握信息技術發展水平及趨勢對于政工干部培養產生的影響，科學利用信息技術的強大功能來提高政工干部培養的質量，是所有企事業單位需要思考的問題，婦幼保健院也不例外。
一、信息技術發展對婦幼保健院政工干部培養的影響
1.信息技術發展對政工干部素質提出了更高的要求
信息技術的發展使得信息化素質成為政工干部的基本素質之一，婦幼保健院的政工干部也不例外。信息化素質是指主體所擁有的各種信息品質，包括信息智慧、信息道德、信息意識、信息覺悟、信息潛能和信息心理等內容。信息化素質能讓政工干部跟上時展的潮流，掌握最新的信息技術，也能讓政工干部認識到信息的重要性而自覺地利用信息提高工作質量，培養政工干部終身學習意識。婦幼保健院作為醫療體系的一部分，一些醫療技術和醫療設備更新速度很快，政工干部必須具備較高的信息化素質才能捕捉到這些信息。具體來說，信息技術的發展要求婦幼保健院的政工干部全面提高自身素質，學好信息知識、掌握信息技能的同時，還要學習政工理論知識、醫療專業知識及人文社科知識等，培養政工干部的領導管理能力、溝通交流能力等。
2.信息技術發展對政工干部素質培養提供了新的條件
信息技術的發展改變了傳統的信息的載體形式，拓寬了信息傳播的渠道，極大地縮短了信息傳播所需要的時間，使個人獲得信息的成本大大降低，為政工干部的培養創造了有利的條件。首先，政工干部學習、溝通渠道更廣。婦幼保健院可以在政工干部的培養課程中使用各種計算機輔助教學方式，它使課程內容更加生動有趣，能更好地激發政工干部的學習興趣；依靠網絡教學的方式還可以讓政工干部充分利用網上豐富的信息資源，相互交流學習；此外政工干部還可以合理安排自己的學習時間，選擇自己的學習方式，培養方式更加個性化。其次，政工干部利用信息的方式發生了改變。過去婦幼保健院的政工干部獲取信息主要靠閱讀各種紙質材料，現在政工干部閱讀的載體擴展到網絡信息，從文字擴展到圖像、聲音、三維等；在表達方式上實現了從直接手寫到鍵盤輸入、掃描等，包括直接復制或者刪減其他文件；在計算方式上也不再需要人工計算，利用計算機準確又迅速減輕了政工干部數據統計分析的負擔。
3.信息技術發展對政工干部素質培養帶來的問題
首先，信息鴻溝現象比較嚴重。在婦幼保健院的政工部門中，政工干部的能力有高有低，在掌握和使用現代信息技術方面也存在較大差異，這給政工干部的信息培養課程增加了不小的難度。其次，網絡信息量過于龐大。信息技術的發展使得，各種信息都能在網絡上迅速傳播，過量的信息會使人們很難找到自己所需要的信息，造成信息利用效率的下降，其中一些有害的信息更是嚴重影響政工干部的培養工作。
二、提高婦幼保健院政工干部培養質量的對策
1.定期完善政工干部培養方案
信息技術的發展變化是日新月異的，婦幼保健院要保證政工干部的培養緊跟時代的步伐就必須根據時代的變化對培養方案和教學計劃進行全面的調整和修訂，但是不能改變的是要始終強調培養信息化素質的重要性。培養方案的完善和修改可以從以下幾方面入手：教學目標、教學內容、教學課程專題、教師師資、教學材料和教學組織形式等，要突出強調信息化素質的地位。
2.精心設計培養的專題體系
婦幼保健院政工干部培養的基本平臺就是課程專題，怎樣設計合理的課程專題也成為政工干部培養工作的難題，可以明確的是必須要依據信息技術的發展對各類政工干部知識能力素質的客觀要求來建立課程專題體系，同時也要根據不同教學對象的性質、層次和類型做出調整。要根據政工干部的培養目標確定專題的類別和課時比例，各類專題都有圍繞解決新時期思想政治教育工作來設計，專題設置和內容都要做到內容精干、素材新穎、實在管用，不僅要包括信息化知識和技術的課程，還要有其他方面的課題。
3.打造政工干部培養的環境條件保障體系
婦幼保健院可以從以下幾個方面來支持政工部門的信息化工作。首先，配置完備的教學設施設備，包括計算機及網絡、多功能教室等。其次，建設多樣的信息化教學信息資源子系統，例如數字化圖書館信息資源、課程網絡信息資源、教學管理信息資源等。
總之，為了讓信息技術的發展更好地為婦幼保健院的政工干部培養工作服務，需要站在全局的高度將信息技術理論和方法應用到培養的全過程中，需要對政工干部培養的形式、內容、方法進行深刻變革，以提高政工干部培養的效率，全面提高政工干部信息化素質培養的質量和效益。
參考文獻：
[1]周軍、夏婷婷，論信息技術發展對政工干部培養影響及其對策，中國信息界，2012（05）
[2]梁晨，努力提高政工干部的信息素質，經濟研究導刊，2010（08）
【關鍵詞】 骨髓基質干細胞;誘導分化;成骨細胞
【中圖分類號】R414.1【文獻標識碼】B【文章編號】1005-0515(2010)009-0010-01
骨髓基質干細胞(bone marrow stromal stem cells, BMSCs)是一類具有分化潛能的成體干細胞,在特定條件下可以分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肝細胞、神經細胞等多種細胞,被認為骨組織工程中的最佳種子細胞。本實驗通過貼壁培養法和密度梯度離心法分離成年大鼠骨髓基質干細胞,定向成骨分化,并檢測細胞表面標志、堿性磷酸酶活性和細胞礦化作用。
材料和方法
1 材料
1.1 實驗動物。成年wistar 大鼠,雌雄不限,體重150~180 g ,由浙江大學華家池動物實驗中心提供。
1.2 實驗試劑。胎牛血清,胰蛋白酶(Hyclone),(杭州四季清生物技術有限公司),B一甘油磷酸納(Sigma,USA),地塞米松(Sigma,USA),維生素C(Sigma,USA),小鼠抗大鼠OC單克隆抗體(R-D,USA),兔抗大鼠CD4(BA0532)、CD44(BA0321)、CD54(BA0541)、CD105(BA1725)、Fibronectin(BA1772)、Collagen Ⅰ(BA0325)、EGFR1(B0485)親和純化抗體(武漢博士德公司)
2 方法
2.1 BMSCs的分離和培養:成年wistar大鼠麻醉后處死,無菌條件下取股骨.用含10%FBS的高糖DMEM培養液沖洗骨髓腔.制成骨髓單細胞懸液。接種于培養皿中,置37℃、5%CO2培養。于72h半量更換培養液,以后每3d半量換液1次。加入成骨誘導培養液進行分化培養.對照組加入等量基礎培養液。
2.2 免疫細胞化學檢測rBMSCs的表面標志: 取生長良好的3~5代rBMSCs以1.2×105/ml細胞懸液以1ml接種于蓋玻片,待細胞單層融合至65%左右時,細胞爬片采用SP檢測。
2.3 rBMSCs成脂向誘導分化:取生長良好的3~5代rBMSCs接種培養,貼壁24h后換用成脂誘導劑,取誘導30d后的細胞進行蘇丹Ⅳ染色。
2.4 rBMSCs骨向誘導分化:取生長良好的3~5代rBMSCs接種培養,貼壁24h后換用成骨誘導劑,取誘導15d、30d后的細胞進行礦化結節染色。
3 結果
3.1 原代培養的BMSCs接種24h后,即出現零星貼壁細胞。72h后開始增殖,生長良好,貼壁較均勻。BMSCs呈紡錘狀,有突起。約10d時,細胞匯合成片,其融合率可達到80%~90%,有接觸抑制現象。
3.2 rBMSCs表達出許多的非特異性的表面標志物。DAB顯色CD44、CD54、CD105、Fibronectin、Collagen Ⅰ、EGFR1陽性,CD34陰性。
3.3 rBMSCs脂向誘導分化培養中細胞形態出現明顯的變化:扁平,多為原盤狀,可見細胞突起。細胞誘導10d后胞漿中出現致密的黑色點狀物,被大量的“小白點”狀的脂滴前體分割。14d后,出現少量高折光性脂滴,隨著時間推進,不斷增多并形成大脂滴。綠色濾光片下可見清晰的脂滴;蘇丹Ⅳ染色顯示紅色脂滴。
3.4 rBMSCs骨向誘導分化培養中,誘導15d就有較多高折光性小顆粒沉積,并可見局部融合,30d時,可見大量結節,幾乎覆蓋整個細胞層。
4 討論
骨髓基質細胞又被稱為“間充質干細胞”或“骨源性干細胞”。近年來研究發現還可以分化為星形膠質、少突膠質細胞及神經元,所以又稱為多潛能成體干細胞。分離骨髓間充質干細胞有多種方法:免疫磁珠分離法[1]和流式細胞儀法[2]因費用高、需骨髓量大、操作復雜而較少應用。全骨髓法[3]即貼壁細胞分離法雖方法簡單但所獲細胞純度不高;密度梯度離心法[4]是根據骨髓中各細胞成分比重不同離心分離培養,簡單易行,所獲得的細胞純度較高。
本實驗選用密度梯度離心法分離培養的細胞經過3~5代的傳代,細胞形態趨于一致;免疫熒光檢測顯示培養的細胞CD44、CD54、CD105、Fibronectin、Collagen Ⅰ、EGFR1陽性,CD34陰性。于文獻報道[5]相一致。雖然這些不是特異性的細胞表面標志物,但可以用以鑒別參考。
多向分化潛能是骨髓基質干細胞最重要的生物學特性[6~7]。本研究表明分離培養的細胞在體外誘導的情況下,既可以誘導為脂肪細胞,又可以誘導成為成骨細胞。因此,體外誘rBMSCs骨向分化可以很好地模擬骨髓基質干細胞向骨祖細胞、成骨前體細胞、成骨細胞、骨細胞分化的整個過程,是體外研究成骨功能及骨代謝的理想細胞生物模型。
參考文獻
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【摘要】 目的研究柴胡皂苷-d（SS-d）對乙醇損傷大鼠原代培養肝細胞保護的作用和機制。方法采用胰蛋白酶消化、分離大鼠肝細胞進行原代培養，乙醇體外誘導肝細胞損傷，以不同濃度的SS-d對肝細胞保護，檢測培養液中丙氨酸氨基轉移酶（ALT）活性和肝細胞內丙二醛（MDA）含量、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）的活性，MTT法檢測肝細胞存活率。結果SS-d（1.0，2.0，3.0mg·L－1）明顯改善肝細胞存活率，抑制乙醇引起的ALT活性的升高，對肝細胞中MDA含量升高和GSH-px活性降低均有明顯的抑制作用。結論SS-d對乙醇損傷大鼠肝細胞有保護作用，其機制可能與SS-d清除自由基、抑制質脂過氧化作用有關。
【關鍵詞】 乙醇 肝細胞 原代培養 柴胡皂苷-d 保護作用 機制
隨著人們生活水平的提高和飲酒量的增加，酒精對肝臟的損害日漸突出。了解酒精對肝損傷的機制，篩選有效預防和治療酒精性肝損傷的藥物應用于臨床，是亟待解決的重要課題。目前，中藥復方對酒精性肝損傷的實驗研究和報道比較多，單味制劑報道較少。柴胡皂苷（saikosaponins SS）是中藥柴胡的有效成分，根據其化學結構不同可分為柴胡皂苷a、柴胡皂苷b、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d等，以柴胡皂苷d(SS-d)藥理活性作用最強。整體水平研究表明柴胡皂苷對酒精性肝損傷有預防作用［1］。本文建立體外乙醇損傷肝細胞模型，在細胞水平上進一步研究柴胡有效成分SS-d對乙醇損傷肝細胞的保護作用機制。
1 器材與方法
1.1 藥品與試劑 SS-d（純度98%），昆明長春花科技有限公司提供，臨用前以蒸餾水配制；Hanks液高壓滅菌，4℃保存；1.0 g·L－1胰蛋白酶，用Hanks液溶解，過濾除菌，調pH 7.2，分裝，-30℃保存；基礎培養液，RPMI1640培養基10.0 g，用超凈水900 ml溶解，5.6%NaHCO3調pH至7.2，定溶到1 000 ml，過濾除菌，臨用前每80 ml，加入新生小牛血清20 ml，青霉素100 U·ml－1，鏈霉素100 μg·ml－1，胰島素5 μg·ml－1；MTT：SIGMA公司；ALT，MDA，GSH-px測定試劑盒，南京建成生物工程研究所。
1.2 動物 SD大鼠，2～4 d齡乳鼠，雌雄不限，清潔級，承德醫學院實驗動物管理中心提供。
1.3 儀器 CO2培養箱（Taibai LNA-122D 日本），MD-100半自動生化分析儀（美國Bayer公司），721W微機型分光光度計（上海光學儀器五廠），離心機（TGL.16G 上海）。
1.4 肝細胞分離培養［2］取新生2～4 d大鼠30只，75%乙醇浸洗后斷頭放血，無菌分離肝臟，去除肝臟外膜及其周圍結締組織，置Hanks液中，灌注沖洗肝臟至灰白色，將肝臟剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的組織塊，用Hanks沖洗數次，除去血細胞，加入0.8g·L－1胰蛋白酶10 ml，37℃孵育12 min，加入數滴血清終止消化，用滴管輕吹打成細胞懸液，經200尼龍篩網過濾后用培養液洗2次，1 000 r離心5 min，收集肝細胞，臺盼藍活細胞計數>85%，按1 ×109個·L-1接種于鋪有鼠尾膠原的24孔和96孔板中，37℃，5%CO2條件下培養24 h后更換培養液去除血細胞，繼續培養72 h后進行分組實驗。
1.5 乙醇誘導肝細胞損傷模型的建立將含肝細胞培養液的96孔板，設正常對照組及乙醇25，50，75，100 mmol ·L－14個劑量組，肝細胞懸液與不同濃度乙醇繼續培養12 h，取培養液按賴氏法測定ALT活性，MTT法測定肝細胞存活率。
1．6 MTT法選擇SS-d的實驗濃度 SS-d初濃度為5 mg/L，采用細胞培養液進行稀釋，依次為5.0 ，4.0，3.0 ，2.0 ，1.0 ，0.5 mg·L－1。將肝細胞接種于96孔板培養72 h更換培養液，換用SS-d稀釋液培養，另設空白對照組，12 h后吸出培養液，各孔加入0.05%MTT200 μL，37℃孵育4 h，去上清液，各孔加入二甲基亞砜200 μl，混勻以溶解被還原的MTT結晶，檢測波長為492 nm的光密度值，計算藥物不同稀釋濃度下細胞的存活率。
1.7 SS-d對乙醇誘導肝細胞損傷的保護作用取培養72 h肝細胞，設乙醇損傷模型組、SS-d(1 .0，2 .0，3.0mg·L－1)3個劑量保護組、正常對照組，每組設8個復孔。模型組和SS-d組加入乙醇100 mmol·L－1，同時SS-d組加入不同濃度的SS-d，正常對照組加不含血清的培養液，繼續培養12 h，收集培養上清液檢測ALT活性，收集肝細胞檢測MDA含量和GSH-px的活性，MTT法測定肝細胞的存活率。
1.8 統計學處理 數據以 表示，用SPSS計算機軟件進行統計學分析， 組間比較采用t檢驗，P
2 結果
2.1 乙醇對原代培養肝細胞的損傷不同濃度的乙醇作用于肝細胞，對細胞有劑量依賴性的損傷作用，25 mmol·L－1作用不明顯，光鏡下細胞形態基本正常，隨著濃度的增大，肝細胞存活率呈進行性降低，反映肝細胞損傷的酶ALT逐漸升高；鏡下觀察肝細胞損傷明顯，細胞結構不清，核融解和核膜破裂，其中100 mmol ·L－1乙醇作用最明顯，我們選擇乙醇濃度為100 mmol ·L－1制備肝細胞損傷模型。見表1。表1 不同濃度乙醇對肝細胞ALT水平及細胞存活率的影響 與空白對照組比較#P＜0.05，##P＜0.01；n=6
2.2 SS-d 實驗濃度的選擇SS-d不同濃度時細胞存活率見表2，為避免藥物濃度過大所致的細胞毒性作用，應選擇對細胞生長無明顯影響即肝細胞存活率在90%以上的濃度(1.0 ，2.0 ，3.0 mg·L-1)作為實驗所用藥物濃度。見表2。表2 不同濃度SS-d對肝細胞存活率的影響與空白對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；n=6
2.3 SS-d對乙醇損傷肝細胞的保護作用 100 mmol·L－1乙醇作用肝細胞后，肝細胞損傷明顯，大量細胞壞死，細胞內ALT釋放量明顯升高，細胞內MDA含量明顯增高，GSH-px活性明顯下降；而給予SS-d保護后， 培養液中ALT水平明顯降低；肝細胞MDA含量明顯降低，GSH-px活性明顯升高；并且肝細胞存活率明顯升高。具有明顯的劑量依賴性(P＜0.05，P＜0.01)。表明：SS-d能夠保護肝細胞、穩定肝細胞膜的結構，其保護作用可能與抗脂質過氧化作用有關。見表3。表3 SS-d對乙醇損傷肝細胞ALT，MDA，GSH-px水平與對照組比較，*P＜0.01，與模型組比較#P＜0.05，##P＜0.01；n=6
3 討論
大量研究表明，乙醇對肝細胞損傷是通過自由基介導脂質過氧化作用進行的［3～5］。乙醇在肝臟代謝時產生大量自由基，自由基除直接損傷肝細胞外，可引起肝細胞膜發生脂質過氧化反應，使細胞膜和細胞器結構破壞，膜流動性失常，大量肝內酶（ALT，AST）釋放入血，并可抑制抗氧化劑谷胱甘肽的合成，減弱抗氧化酶（GSH-px）的抗氧化能力，使肝細胞代謝紊亂，肝功能異常，肝細胞廣泛脂肪樣和空泡樣變性，最終導致細胞腫脹死亡［6］。因此，清除自由基抑制脂質過氧化反應，才能保護肝細胞，恢復肝細胞結構和功能的完整性。
SS是柴胡的主要成分，研究表明，SS對實驗性肝損傷具有明顯的保護作用［7，8］。但對單體SS－d保肝作用研究報道較少。因此，我們利用乙醇制備體外肝細胞損傷模型，在細胞水平上對SS-d保肝作用機制進行探討。本研究顯示，模型組肝細胞培養液中ALT活性明顯升高，肝細胞脂質過氧化反應產物MDA含量增加，GSH-px活性降低，細胞存活率明顯下降，表明乙醇可引起肝細胞氧化損傷；給予SS－d保護后，和模型組比較，肝細胞培養液中ALT活性明顯較低，MDA含量明顯降低，GSH-px活性明顯升高，肝細胞存活率亦有明顯升高。提示，SS-d對乙醇損傷肝細胞有明顯保護作用，其機制可能是：①SS-d能增強機體內抗氧化防御能力，抑制自由基的產生；②穩定肝細胞膜系統，提高膜結構的穩定性，促進肝細胞增殖，防止肝細胞損傷和壞死。
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2010年諾貝爾生物醫學獎授予英國生理學家羅伯特•愛德華茲，以表彰他在“體外受精”技術領域做出的開創性貢獻。
1978年，羅伯特•愛德華教授和同事一起成功地使第一例試管嬰兒誕生，從此開創了生殖醫學領域的新紀元。試管嬰兒在20多年前也曾被世界輿論界視為洪水猛獸而大加抨擊，但時至今日，這項技術已經被全世界絕大多數國家承認，堪稱醫學史上的一大奇跡。迄今為止，全球已有上百萬試管嬰兒誕生。
被譽為“試管嬰兒之父”的英國劍橋大學教授羅伯特•愛德華說：“克隆單純從技術上講非常簡單，就是把卵細胞中DNA去掉，然后將體細胞中的DNA移入其中。這在世界上任何一個試管嬰兒實驗室中都可以完成，困難在于如何降低克隆的危險。”
本文以此熱點問題作為命題材料，對2011年高考生物試題進行單項預測。預測材料及其涉及的知識、試題如下：
1．試管嬰兒
【知識鏈接】要做好有關“試管嬰兒”的試題，除了書本上的知識外，還要掌握“試管嬰兒”技術的有關知識。“試管嬰兒”技術是通過將不孕夫婦的和卵細胞取出在試管中完全受精，并在試管中培養使其發育到囊胚期，再將胚胎移入女性子宮內使其發育成胎兒。
體外受精步驟包括：的采集與培養、卵母細胞的獲取與培養、體外受精等操作技術。具體過程如下圖:
哺乳動物胚胎發育的過程大體概括如下圖：
例1 下列關于關試管嬰兒的說法，不正確的是（）
A. 從良種母牛體內采集的卵母細胞都需要進行體外培養
B. 從良種公牛采集的需進行獲能處理
C. 早期胚胎移植的意義在于提高優良母畜的繁殖率
D. 早期胚胎指的是由受精卵發育至原腸胚時期的胚
解析：本題考查了試管嬰兒的相關知識。根據體外受精和胚胎發育過程圖解可知，早期胚胎指的是由受精卵發育至囊胚時的胚。
答案：D
例2 據2008年1月17日《干細胞》雜志報道，某科學家使用了進行試管受精的年輕女性捐獻的卵子，以及2名志愿者的皮膚成纖維細胞，成功克隆出了5個人體胚胎，進而可以開發出有研究價值的干細胞。請回答：
（1）上述過程中主要應用到的兩項動物細胞工程技術為；若將某經過修飾的基因導入其中的部分胚胎干細胞，常用的方法是。
（2）在使用合成培養基進行胚胎干細胞培養時，通常需要加入等天然成分；在細胞培養時，要保證被培養的細胞處于一定的氣體環境，所需要的氣體主要有 。
（3）科學家欲進行胚胎分割移植，則應該選擇發育良好、形態正常的或囊胚，將其移入盛有操作液的培養皿中，然后用分割針進行分割。
答案：（1）動物細胞培養、細胞核移植顯微注射技術（法）
（2）血清（血清、血漿） 氧氣和二氧化碳 （3）桑葚胚
2．克隆人研究
【知識鏈接】克隆人的基本原理是動物細胞核的全能性，包括胚胎細胞核移植和體細胞核移植。其基本過程為：
細胞核移植技術中注入去核卵母細胞中的不是供體細胞核，而是整個細胞，伴隨著兩細胞融合，體現細胞膜的結構特點：具有一定的流動性。該技術形成重組細胞繼而發育成一個新個體，體現了細胞核的全能性而非動物細胞的全能性。
例3 下圖為克隆人的示意圖，據圖回答：
（1）圖中所涉及的現代生物技術有、和
等。
（2）下列有關胚胎移植的敘述正確的有（）
A.沖卵指的是從子宮中沖出胚胎，而非沖出卵子
B.只有供、受體生理環境高度一致，移入受體的胚胎才能被接受，并繼續發育
C.供體和受體要進行免疫檢查，防止發生免疫排斥反應
D.不同動物其胚胎移植的時間不同，人的胚胎移植最好在四個細胞階段進行
（3）圖中兩個嬰兒長大后，外貌、性格和其他特征與原型男人相同，這說明 具有全能性。
（4）使用培養基進行胚胎干細胞培養時，通常要加入等天然成分，除了保證被培養細胞處于無菌、無毒及充足氧氣的環境中，還需要保證細胞生活所需的；早期胚胎發育在階段以前的細胞是全能細胞。
（5）圖中從“內細胞團到胚胎干細胞”的培養過程中，必須用處理內細胞團，使之分散成單個細胞。干細胞形成組織、器官必須要進行 和 。
（6）在體外培養胚胎干細胞能否獲得動物器官?
。為什么？
解析：（1）該圖利用了細胞核移植、動物細胞培養、胚胎分割移植等技術。（2）沖卵一般是指是胚胎收集中的沖卵――胚胎、早期胚胎。供體和受體只有保證具有相同的生理狀態，才能保證胚胎的正常發育。（3）克隆過程說明動物細胞核具有全能性。（4）動物細胞培養液的成分包括葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清等。動物細胞培養的條件：無菌、無毒的環境；營養物質（合成培養基）；溫度和pH（36.5±0.5℃，7.2～7.4）；氣體環境（氧氣和二氧化碳）等。（5）動物細胞培養過程常用胰蛋白酶處理組織，以使之分散成單個細胞。（6）胚胎干細胞在體外培養條件下一般只能增殖進行細胞分裂，不能發生細胞分化。
答案：（1）核移植 胚胎移植 細胞培養（另外寫細胞融合、胚胎分割也對，寫了三個則給滿分）（2）ABD（3）動物體細胞核 （4）血清 溫度和pH 桑葚胚（5）胰蛋白酶 細胞的分裂 分化 （6）不能 胚胎干細胞在體外培養條件下可以增殖而不發生分化
3．生物技術中的倫理問題
【知識鏈接】生物技術引發的倫理問題包括克隆技術引發的倫理問題、試管嬰兒引發的倫理問題、基因檢測引發的倫理問題。中國政府對于克隆技術的態度是禁止生殖性克隆人，不反對治療性克隆人；對于試管嬰兒的態度，中國衛生部的規定是實施體外受精、胚胎移植及衍生技術必須獲得衛生部的批準證書。
例4下圖所示為人類“治療性克隆”的大致過程。請回答下列問題：
（1）圖中①為 細胞，過程A是目前實現體細胞克隆的關鍵技術，該技術稱為 。
（2）圖中③能誘導分化出神經細胞、血細胞、肌肉細胞，其根本原因是 的結果。這樣培育得到的組織器官進行自體移植的最大好處是 。
（3）若應用轉基因技術治療遺傳性糖尿病，可將健康人的控制胰島素合成的基因導入結構④中的
，原因是這些細胞 。
（4）在用PCR技術擴增胰島素基因時，緩沖溶液中必須加入的物質有：、分別與兩條模板鏈結合的兩種引物、 以及四種脫氧核苷酸。DNA的合成方向總是從子鏈的延伸。
（5）我國政府禁止生殖性克隆，但不反對治療性克隆研究。為什么要反對生殖性克隆（即克隆人）呢？請你寫出一條理由： 。
解析：從圖可以看才出，治療性克隆是將患者的體細胞的核與卵細胞的細胞質進行重組， 形成重組細胞，將重組細胞經過培養得到囊胚，取囊胚內細胞團培養得到不同組織器官，可用于進行自體移植，不會產生免疫排斥反應。
答案：（1）次級卵母（卵） 核移植
（2）基因選擇性表達不會產生排異（免疫排斥）反應
（3）內細胞團分化程度極低（或具有全能性），可使外源基因在相應組織細胞表達
【關鍵詞】 消化液； 添加物； 牛胚胎干細胞； 克隆效率
胚胎干細胞（ES細胞）是具有全能性的哺乳動物早期胚胎細胞或原始細胞。胚胎干細胞在分化抑制的培養條件下，可以未分化狀態無限增殖。近年來有關牛類ES細胞分離與克隆的研究已經取得較大進展[1-2]。筆者為探討添加物和消化液對牛胚胎干細胞克隆效率的影響，通過從牛鮮胚內細胞團（ICM）中分離獲得牛類ES細胞后進行克隆，在培養細胞中添加胰島素生長因子和消化液，現報道如下。
1 材料與方法
1.1 牛胚采集 在自然期，對健康經產黑白花奶牛母進行人工受精后68 d經非手術方法從牛子宮取胚胎。將待采集胚胎的母牛固定在床位上，在尾椎硬膜外腔注射 2% 鹽酸利多卡因麻醉。按規定方法在沖洗兩側子宮角。沖出的胚胎要在立體顯微鏡下檢查。在100倍實體解剖顯微鏡下觀察受精卵的形態、色調、分裂球的大小、均勻度、細胞的密度、與透明帶的間隙以及變性情況等[3-4]。
1.2 溶液配制 細胞基礎培養液：DMEM+0.1 mM 2-mercap-toethanol（在此基礎上，添加不同濃度的血清及各種細胞因子）；細胞基礎消化液：胰蛋白酶+EDTA（在此基礎上，兩者濃度有所調整）。
1.2.1 飼養層制備 選取新生健康黑白花牛犢制備成纖維細胞，取3代內對數生長期MEF， 終濃度10μg/ml 絲裂霉素C處理 3.5 h， D-PBS充分洗滌，消化細胞調整細胞濃度為1×105個/ml，種植在經 0.1%明膠包被的4孔培養板中，置37 ℃、5% CO2培養箱培養待用，用前更換成胚胎干細胞培養基。
1.2.2 胚胎處理和胚胎培養條件 基礎培養液為DMEM培養基+15%NBS+0.1mmol/L 0.1 μmol/L Na2SeO3+β琉基乙醇。室溫下培養牛胚胎及ES細胞。
1.2.3 ICM初次傳代 將ICM細胞體外培養6～7 d后，當細胞繁殖到一定數目時，選擇未分化的細胞進行傳代。操作如下：用玻璃針剝離覆蓋在ICM表面的滋養層細胞后挑出ICM，用PBS洗滌液清洗后，置入0.02%EDTA消化液+0.125%胰蛋白酶消化液中處理后，將細胞轉入15%的血清培養液中，制備細胞團懸混液。培養條件同上。
1.2.4 牛ES細胞繼代克隆 ICM細胞培養35 d后，飼養層表面可出現類似ES細胞的集落。棄去培養液，用PBS液洗滌集落，再用玻璃針剝脫隆起明顯、排列緊密的ES細胞集落，再用毛細吸管將集落移入培養液中。
1.3 研究方法 在DMEM培養基中加入10 ng/ml的IGF（設為IGF組）觀察牛ES細胞的克隆結果與未加IGF（設為對照組）時做比較，在離散ICM和ES集落時，分別用0.02%EDTA消化液+0.125%胰蛋白酶消化液（A組）和0.04%EDTA消化液+0.25%胰蛋白酶消化液（B組），作用時間控制為2 min，溫度37 ℃。
1.4 統計學處理 采用SPSS 16.0統計學軟件對數據進行統計處理，計數資料采用 字2檢驗，以P
2 結果
不同條件對牛ES細胞克隆的影響情況，具體結果見表1。
3 討論
胚胎干細胞具有全能性，能再體外條件下分化為各器官系統細胞，亦可在分化抑制的情況下進行未分化狀態克隆，胚胎干細胞克隆技術廣泛運用于轉基因動物、嵌合體的制作和克隆動物的生產，目前有關牛胚胎克隆的研究取得了重大進展[4-5]。為探討不同條件對牛ES細胞克隆的影響，筆者探討了在不同濃度消化液及在胰島素生長因子作用下，牛ES細胞克隆的變化。牛ES細胞在以上配置的培養液中培養形成ES細胞集落胚數/枚ES 2枚，細胞最大傳代數2代。在培養液中加入10 ng/ml的IGF牛ES細胞集落胚數為3枚，細胞最大傳代數4代，可見IGF對牛ES細胞克隆有促進作用。在ICM細胞與ES細胞分離時用0.02%EDTA消化液+0.125%胰蛋白酶消化液處理2 min，形成ES細胞集落胚數/枚ES 9枚細胞最大傳代數4代。用0.04%EDTA消化液+0.25%胰蛋白酶消化液分離牛ES細胞集落胚數為8枚，細胞最大傳代數4代。因此，在分離ICM細胞和ES細胞時注意，選擇適當濃度的消化液，且作用時間不宜過長[6-8]。通過本實驗可得出在進行牛ES細胞培養時，可利用一定的添加物促進ES細胞克隆，促進其繁殖，而對于分離ICM和ES細胞的消化液，須嚴控其濃度和作用時間。
參考文獻
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