發酵劑對鱘魚糜中生物胺的影響

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鱘魚為鱘形目魚類的總稱，是現存起源最早的脊椎動物之一，生長快、病害少，因肉質鮮美，無肌間刺，具有抗癌、美容養顏的作用，深受廣大消費者的喜愛。２０１９年全國鱘魚養殖量為１０２０４２噸，其中，貴州的養殖量達１４１０１噸［１］。目前貴州省內的鱘魚多以鮮銷為主，經濟附加值較低。發酵作為一種用于貯藏食品并增強食品風味的加工技術，可以提高食品的風味與營養品質［２］。發酵食品是讓益生菌進入體內的良好方式［３］，但與此同時，發酵制得的食品會產生包括生物胺在內的有毒物質［４］，為食用者帶來健康隱患，其中，富含生物胺的發酵肉制品以發酵香腸和水產品為主［５］。生物胺（ｂｉｏｇｅｎｉｃａｍｉｎｅｓ，ＢＡｓ）是一種低分子量、有生物活性的含氮化合物的總稱［６］。微量生物胺對機體無害，但是當過量攝入時，會引發一系列的不良反應，如發燒、過敏反應、神經毒性［７－９］。因此，控制食品中的生物胺含量可有效提高食品的安全性。有研究表明，將對人體無害的有益菌種接種到魚體中能抑制生物胺的合成［１０－１２］；植物乳桿菌可提高發酵食品的風味和安全性［１３－１４］。但是單一菌種發酵過程中會出現生物胺累積的風險，而復配發酵劑可彌補該缺陷，使各菌種發揮其優勢［１５］。魚糜制品是將魚肉絞碎后加鹽擂潰、調味，進行水煮、油炸等處理而制得，是優質蛋白質的重要來源［１６］，且擁有廣闊的市場前景［１７］。利用發酵工藝制得的魚糜制品可賦予產品良好的品質和保健功能，目前市場上發酵鱘魚糜制品較少。本研究以雜交鱘魚為原料，探討鱘魚糜在發酵過程中生物胺含量的變化情況，為鱘魚的精深加工提供理論參考，并在一定程度上推動鱘魚加工產業的發展。

１材料和方法

１．１材料與試劑

雜交鱘魚：貴州省水產研究所惠水基地；食鹽、玉米淀粉、胡椒粉、白砂糖、料酒、蔥姜粉：食品級，采購于貴陽市合力超市花溪店。植物乳桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）、戊糖片球菌（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）：廣東省微生物菌種保藏中心；ＭＲＳ培養基：青島日水生物技術有限公司；組胺、精胺、亞精胺、尸胺、苯乙胺、腐胺、色胺、酪胺（均為色譜級）：美國Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ公司；正己烷、丙酮、乙腈（均為色譜級）：美國Ｆｉｓｈｅｒ公司；丹磺酰氯（純度９７％）、三氯乙酸（純度９９％）：上海薩恩化學技術有限公司；氨水（分析純）、甲酸銨（ＬＣ－ＭＳ級）：上海阿拉丁試劑有限公司；碳酸氫鈉、氫氧化鈉（均為分析純）：上海易恩化學技術有限公司。

１．２儀器與設備

ＬＣ－２０ａ高效液相色譜儀日本島津公司；Ｔ－２５勻漿機德國ＩＫＡ公司；ＬＤＺＦ－５０Ｌ立式高壓蒸汽滅菌鍋上海申安醫療器械廠；ＳＷ－ＣＪ－１Ｆ垂直流潔凈工作臺吳江市偉峰凈化設備有限公司；ＷＰＬ－１２５電熱恒溫培養箱天津市泰斯特儀器有限公司；Ｍｉｌｌｉ－ＱＩＱ７０００純水儀德國密理博公司；ＳＱＰ電子天平賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。

１．３方法

１．３．１發酵劑的制備無菌條件下，分別吸取０．３ｍＬ的無菌水，滴入植物乳桿菌和戊糖片球菌凍干管中，輕輕振蕩至溶解，吸取全部菌懸液，分別接種于ＭＲＳ固體培養基上，３７℃純化培養，得實驗用發酵菌株。用麥氏比濁法將發酵菌株用無菌生理鹽水稀釋成１０８ＣＦＵ／ｍＬ的菌懸液，即得發酵劑。１．３．２樣品的制備及處理冷凍鱘魚肉于４℃解凍，漂洗２次，瀝干水分，用絞肉機絞成魚肉糜，以魚糜總量百分比計，加入２％食鹽、８％玉米淀粉、２％白砂糖及適量香辛料（料酒、胡椒等）、１％發酵劑（植物乳桿菌∶戊糖片球菌為１∶１），攪拌均勻，真空包裝，未接種發酵劑組作為對照組。２６℃發酵培養，發酵０，１２，２４，３６，４８，６０ｈ時測定生物胺含量，每個樣品平行測定３次。１．３．３生物胺標準溶液的配制稱取色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺８種標準品各５．１，１３．９，３．１，８．３，２．１，１．７，３．５，１．３ｍｇ，然后用０．１ｍｏｌ／Ｌ的鹽酸分別定容到１０ｍＬ，并分別稀釋為５１０，１３９０，３１０，８３０，２１０，１７０，３５０，１３０μｇ／ｍＬ的母液，分別稀釋１００，８０，５０，２５，２０，１０倍，配制成混標溶液。１．３．４生物胺的柱前衍生取１ｍＬ混標液，依次加入２００μＬ２ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ溶液、３００μＬ飽和ＮａＨＣＯ３緩沖溶液、丹磺酰氯２ｍＬ，轉移至５ｍＬ的容量瓶中，４０℃避光反應４５ｍｉｎ，加入１００μＬ２５％的氨水于暗處靜置３０ｍｉｎ，終止衍生反應后用乙腈定容至５ｍＬ，用０．２２μｍ濾膜過濾備用。１．３．５樣品衍生化取５ｇ樣品，加入１５ｍＬ５％三氯乙酸溶液，均質，于４℃以１００００ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，取上清液，加入１０ｍＬ三氯乙酸溶液重復１次，合并上清液，定容至５０ｍＬ。將其過濾后取濾液１０ｍＬ，加入１／２倍體積的正己烷萃取除脂，分層后去除有機相，重復處理２次。取１ｍＬ除脂后的生物胺提取液依次加入２００μＬ２ｍｏｌ／Ｌ的氫氧化鈉、３００μＬ的飽和碳酸氫鈉溶液及１ｍＬ的丹磺酰氯溶液，混合均勻后于４０℃避光反應４５ｍｉｎ，加入１００μＬ２５％氨水避光保存３０ｍｉｎ，終止反應后用乙腈定容到５ｍＬ，以３０００ｒ／ｍｉｎ離心５ｍｉｎ，上清液用０．２２μｍ濾膜過濾，于４℃備用。１．３．６生物胺的測定ＩｎｓｅｒｔＳｕｓｔａｉｎＡＱ－Ｃ１８色譜柱（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ×５μｍ，日本島津公司），柱溫３０℃，流動相Ａ：０．１ｍｏｌ／Ｌ醋酸銨，流動相Ｂ：乙腈，流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ，進樣量５０μＬ，檢測波長２５４ｎｍ，梯度洗脫程序見表１。析，Ｏｒｉｇｉｎ２０１８作圖。

２結果與分析

２．１生物胺檢測的標準曲線

分別以生物胺濃度和峰面積為橫、縱坐標，繪制標準曲線，得到８種生物胺的線性回歸方程和相關系數，見表２。由表２可知，８種生物胺的相關系數Ｒ２均大于０．９９５，表明這８種生物胺的質量濃度和峰面積之間線性關系良好。

２．２發酵過程中鱘魚糜生物胺含量的變化

生物胺的含量與水產品的品質密切相關，當腐敗微生物使水產品中的游離氨基酸發生脫羧反應時，會生成大量生物胺，從而影響產品質量［１８］。檢測鱘魚糜在２６℃下從０ｈ發酵至６０ｈ的過程中發酵組和對照組中生物胺含量的變化情況，結果見圖１。由圖１中ａ可知，發酵初期，色胺含量為０．１１７ｍｇ／ｋｇ，發酵至６０ｈ時，對照組和發酵組的色胺含量分別為０．４１０ｍｇ／ｋｇ和０．２６１ｍｇ／ｋｇ，發酵組的色胺含量低于對照組，這一結果可能是所用的發酵劑抑制了色胺的積累［１９］。韋宗卉［２０］也發現了類似規律，經乳酸菌發酵，辣椒醬中色胺和腐胺的含量有所降低。苯乙胺作為一種芳香族生物胺，可被單胺酶氧化分解。當人體攝入過量苯乙胺時，會出現失眠、頭痛等不良反應［２１］。由圖１中ｂ可知，發酵初期，對照組和發酵組均未檢出苯乙胺。當發酵至４８ｈ時，對照組中檢測到少量苯乙胺；發酵至６０ｈ時，對照組中的苯乙胺含量由０．０７３ｍｇ／ｋｇ增加至０．４９４ｍｇ／ｋｇ。發酵組中，當發酵至６０ｈ時，苯乙胺含量僅為０．０３５ｍｇ／ｋｇ。因此對于短期的鱘魚糜發酵，苯乙胺或不適合作為評價其腐敗變質的指標。腐胺由鳥氨酸發生脫羧反應形成，普遍存在于水產類食品中［２２］，其能直接參與生物體的部分生理活動，攝入過量會引起頭痛等癥狀［２３］。由圖１中ｃ可知，發酵初期腐胺的含量為０．７０８ｍｇ／ｋｇ，隨著發酵時間的延長，呈現出遞增的趨勢。發酵至４８ｈ后，對照組和發酵組中的腐胺含量均有所降低，其原因可能是隨著發酵的進行，部分腐胺作為前體物質轉化成了亞精胺和精胺［２４］。尸胺和腐胺類似，對人體沒有直接的健康威脅，而是通過抑制組胺代謝酶如單胺或二胺氧化酶和組胺甲基轉移酶的活性來增強組胺和酪胺的毒性效應［２５］，它們能夠與食品中的亞硝酸鹽反應生產致癌物亞硝基胺，因此仍需關注這兩種生物胺在鱘魚糜發酵過程中含量的變化情況。由圖１中ｄ可知，發酵初期，尸胺的含量為０．２６６ｍｇ／ｋｇ，隨著發酵時間的延長，對照組和發酵組的尸胺含量均有所增加。發酵至６０ｈ時，對照組和發酵組的尸胺含量分別為２４．１５０ｍｇ／ｋｇ和１８．６２７ｍｇ／ｋｇ，發酵組較對照組含量有所下降。Ｓｉｍｉｏｎ等［２６］以植物乳桿菌和釀酒酵母菌混合發酵香腸，發現最終香腸中腐胺和尸胺含量下降。本研究也得到類似規律，當發酵至６０ｈ時，發酵組中的腐胺和尸胺含量較對照組均有所下降，與前人的研究結果相似。酪胺的毒性被認為僅次于組胺［２７］，酪胺引起的食源性胺中毒常被稱為“奶酪反應”，歐盟規定酪胺在食品中的限量為１００ｍｇ／ｋｇ［２８］。由圖１中ｇ可知，發酵至６０ｈ時，對照組和發酵組的酪胺含量分別為５．１４４ｍｇ／ｋｇ和４．２６４ｍｇ／ｋｇ，發酵組的酪胺含量較對照組低，該結果可能是發酵劑中的植物乳桿菌對鱘魚糜產生的酪胺進行了一定程度的降解所致，與前人研究的從火腿中分離出的植物乳桿菌和干酪乳桿菌可以不同程度地降解酪胺結果相似［２９］。隨著發酵的進行，對照組和發酵組的亞精胺含量和精胺含量并未呈現出一定的規律性（見圖１中ｅ和ｆ），產生這種現象可能是亞精胺和精胺這兩種生物胺本身的性質不穩定易分解所致［３０］。組胺是水產品發酵過程中所產生的生物胺中對人類健康影響最大的一種［３１］。青皮紅肉類魚等鯖科魚類因富含組氨酸從而易產生組胺，因此組胺中毒又稱鯖科魚類中毒。ＧＢ２７３３－２０１５《鮮、凍動物性水產品》規定，鮐魚、鲹魚、金槍魚及沙丁魚等青皮紅肉海水魚組胺含量不得超過４００ｍｇ／ｋｇ，而其他海水魚類組胺含量不得超過２００ｍｇ／ｋｇ。ＦＤＡ規定進口水產品中組胺含量不得超過５０ｍｇ／ｋｇ［３２］，ＥＦＳＡ規定水產品和食品中組胺含量不得高于１００ｍｇ／ｋｇ［３３］。田甜等［３４］研究發現，接種戊糖片球菌、肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌、漢遜德巴利酵母、清酒乳桿菌５種微生物制備成的復合發酵劑的廣味香腸的組胺含量較自然發酵的降低了１０．１４％，提高了香腸的食用安全性。本研究中發酵６０ｈ時，發酵組和對照組中的組胺含量分別為０．５２１ｍｇ／ｋｇ和０．６８０ｍｇ／ｋｇ，發酵組較對照組的組胺含量低２３．３８％，與前人的研究結果類似。

３結論

水產品中的生物胺在存儲過程中，過高的溫度和較差的生產條件都會增加水產品中生物胺的積累。Ｃｈｏｎｇ等［３５］研究發現，印度鲅魚在２５～２９℃貯藏過程中，除亞精胺和精胺外，其他生物胺的含量均顯著增加。本研究也得出類似規律，色胺、苯乙胺、尸胺、酪胺、組胺這５種生物胺隨著發酵時間的延長其含量均呈現出逐漸升高的趨勢。本研究中，發酵初期，除精胺與亞精胺之外的６種生物胺含量均較低，說明原料鱘魚較新鮮。同時，在發酵過程中，各時間點發酵組中的生物胺含量均低于對照組，說明復合發酵劑對鱘魚糜中生物胺的生成有一定抑制作用，其原因可能是乳酸菌發酵產生的代謝產物抑制了其他有害微生物的生長。翟鈺佳等［３６］以植物乳桿菌為發酵劑，發現羊肉發酵香腸中生物胺的形成被顯著抑制。此外，還有學者發現分離自食物的植物乳桿菌、戊糖片球菌、乳酸片球菌等菌株可在體外降解酪胺和組胺［３７］，這與本研究結果相似。本研究結果表明，復合發酵劑有助于抑制鱘魚糜中生物胺的產生，提高食用安全性，為工業化安全生產發酵鱘魚制品提供了一定的數據支持，同時也為發酵技術在鱘魚加工中的應用提供了一定參考。

作者:才讓卓瑪 曾詩雨 張效平 李小義 劉霆 趙鳳 單位:貴州省農業科學院水產研究所 貴州省特種水產工程技術中心